1. Komenca kompreno

En ĉi tiu etapo, ni devas kompreni kelkajn konceptojn kaj terminologion, por eviti erarojn antaŭ niaj maljunuloj, kiel ekzemple:

Q: Kio estas la diferenco inter RT-PCR, qPCR, Realtempa PCR kaj realtempa RT-PCR?

Respondo: RT-PCR estas inversa transskriba PCR(inversa transskribo PCR, RT-PCR), kiu estas vaste uzata variaĵo de polimeraza ĉena reago (PCR).En RT-PCR, RNA-fadeno estas inversa transskribita en komplementan DNA, kiu tiam estas utiligita kiel ŝablono por DNA-plifortigo per PCR.
Realtempa-PCR kaj qPCR(Kvanta Rea-ltime-PCR) estas la sama afero, ambaŭ estas realtempa kvanta PCR, kio signifas, ke ĉiu ciklo de PCR havas realtempajn datumojn rekordojn, do la nombro de komencaj ŝablonoj povas esti ĝustigita preciza analizo.

Kvankam kaj Realtempa PCR (realtempa fluoreska kvanta PCR) kaj Inversa transskriba PCR (inversa transskriba PCR) ŝajnas esti mallongigitaj kiel RT-PCR, la internacia konvencio estas: RT-PCR specife rilatas al inversa transskribo.PCR, Realtempa PCR estas ĝenerale mallongigita kiel qPCR (kvanta realtempa PCR).

Kaj realtempa RT-PCR (RT-qPCR), Ĝi estas la inversa transskriba PCR kombinita kun la fluoreska kvanta teknologio.: unue akiru cDNA (RT) de RNA inversa transskribo, kaj tiam uzu Realtempan PCR por kvanta analizo (qPCR).Plej multaj laboratorioj faras RT-qPCR, tio estas, esploradon pri RNA-esprimo malsupren-reguligo, do la qPCR pri kiu ĉiuj parolas en la laboratorio fakte rilatas al RT-qPCR, sed ne forgesu, ke ankoraŭ ekzistas multaj DNA-testoj en klinikaj aplikoj.Kvanta analizo, kiel ekzemple hepatito B-virusa HBV-detekto.

Demando: Post legado de multe da fluoreska kvanta PCR, kial la plifortigita fragmento estu kontrolita ene de la intervalo de 80-300bp?

Respondu: La longo de ĉiu gensekvenco estas malsama, iuj estas pluraj kb, iuj estas centoj da bp, sed ni nur bezonas postuli, ke la produktolongo estu 80-300bp dum desegnado de enkondukoj, tro mallongaj aŭ tro longaj ne taŭgas por fluoreska kvanta PCR-detekto .La produktfragmento estas tro mallonga por esti distingita de la primer-dimero.La longo de la enbor-dimero estas proksimume 30-40bp, kaj estas malfacile distingi ĉu ĝi estas enkonduko-dimero aŭ produkto se ĝi estas malpli ol 80bp.Se la produktfragmento estas tro longa, superante 300bp, ĝi facile kondukos al malalta plifortiga efikeco kaj ne povas efike detekti la kvanton de la geno.

Ekzemple, kiam oni kalkulas kiom da homoj estas en klasĉambro, oni nur bezonas kalkuli kiom da buŝoj estas.La sama estas vera kiam vi detektas genojn, vi nur bezonas detekti certan sekvencon de geno por reprezenti La tuta sekvenco faros.Se vi volas kalkuli homojn, vi devas kalkuli kaj buŝojn kaj nazojn, orelojn kaj okulvitrojn, kaj estas facile fari erarojn.

Por ekspansiiĝi, en biologia esplorado, ekzistas multaj esplorkazoj de punkto al areo, ĉar la gensekvenco de iu ajn specio estas tre longa, estas nenecese kaj neeble mezuri ĉiujn fragmentojn, kiel bakteria 16S-sekvencado, kio estas efektivigi la konservativan sekvencon de bakterioj Provoj por konkludi la nombron de certa populacio de bakterioj.

Q: Kio estas la optimuma longeco por qPCR-amor-dezajno?

Respondu: Ĝenerale, la amorlongo estas proksimume 20-24bp, kio estas pli bona.Kompreneble, ni devas atenti la TM-valoron de la enkonduko dum desegnado de la enkonduko, ĉar ĉi tio rilatas al la optimuma kalcia temperaturo.Post multaj eksperimentoj, estis pruvite, ke 60 °C estas pli bona TM-valoro.Se la kalcia temperaturo estas tro malalta, ĝi facile kondukos al nespecifa plifortigo.Se la kalcia temperaturo estas tro alta, la plifortiga efikeco estos relative malalta, la pinto de la plifortiga kurbo komenciĝos poste, kaj la CT-valoro estos prokrastita.

Q: Kiel la tinktura metodo diferencas de la sonda metodo?

Respondo: Tinktura metodoKelkaj fluoreskaj tinkturfarboj, kiel ekzemple SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO, ktp., ne elsendas lumon per si mem, sed elsendos fluoreskecon post ligado al la negrava kanelo de duoble-fadena DNA.Tial, komence de la PCR-reago, la maŝino ne povas detekti la fluoreskan signalon.Kiam la reago atingas la kalson-etendan stadion, la duobla fadeno estas malfermita, kaj nova fadeno estas sintezita sub la ago de DNA-polimerazo, kaj la fluoreska molekulo ligas al la dsDNA negrava kanelo.Ĉar la nombro da PCR-cikloj pliiĝas, pli kaj pli da tinkturfarboj estas kombinitaj kun duoble-fadena DNA, kaj la fluoreska signalo ankaŭ estas ade plifortigita.La tinktura metodo estas ĉefe uzata en scienca esplorado.
PS: Atentu kiam vi faras la eksperimenton, la tinkturfarbo devas esti kombinita kun homa DNA, atentu igi ĝin fluoreska homo.

Tinktura metodo (maldekstre) Sonda metodo (dekstre)
PS: Atentu kiam vi faras la eksperimenton, la tinkturfarbo devas esti kombinita kun homa DNA, atentu igi ĝin fluoreska homo.

SYBR Green Ⅰ ligas al la negrava kanelo de DNA

Sonda metodoTaqman-enketo estas la plej ofte uzita hidrolizsondilo.Ekzistas fluoreska grupo ĉe la 5′ fino de la enketo, kutime FAM, kaj la enketo mem estas sekvenco komplementa al la celgeno.Estas fluoreska estinga grupo ĉe la 3′ fino.Laŭ la principo de fluoreskeca resonanca energitransigo (Förster resonanca energitransigo, FRET), kiam la raportisto fluoreska grupo (donacanto fluoreska molekulo) kaj la estinga fluoreska grupo (akceptanto fluoreska molekulo) estas ekscititaj Kiam la spektroj interkovras kaj la distanco estas tre proksima (7-10nm), la ekscito de la fluoreska molekulo akceptas la fluoreska molekulo, dum la fluoreska molekulo akceptas la fluoreskan molekulon. nce estas malfortigita.Tial, komence de la PCR-reago, kiam la sondilo estas libera kaj nerompita en la sistemo, la raportisto fluoreska grupo ne elsendos fluoreskecon.Dum kalciado, la enkonduko kaj sondilo ligas al la ŝablono.Dum la etendstadio, la polimerazo ade sintezas novajn ĉenojn.DNA-polimerazo havas 5′-3′ eksonukleazaktivecon.Alveninte la enketon, la DNA-polimerazo hidrolizas la enketon de la ŝablono, apartigos la raportan fluoreskan grupon de la estingilo-fluoreska grupo kaj liberigos la fluoreskan signalon.Ĉar ekzistas unu-al-unu rilato inter la enketo kaj la ŝablono, la enketmetodo estas pli bona ol la tinkturfarba metodo laŭ la precizeco kaj sentemo de la testo.La enketmetodo estas ĉefe uzata en diagnozo.

Q: Kio estas absoluta kvantigo?Kio estas Relativa Kvantigo?

Respondu: Absoluta kvantigo rilatas al la kalkulo de la komenca kopinombro de la provaĵo por esti testita per qPCR, kiel kiom da HBV-virusoj estas en 1ml da sango.La rezulto akirita per relativa kvantigo estas la ŝanĝo en la kvanto de la celgeno en specifa provaĵo relative al alia referencprovaĵo, kaj la genekspresio estas supren-reguligita aŭ malsupren-reguligita.

Q: Ĉu la kvanto de RNA-eltiro, inversa transskriba efikeco kaj plifortiga efikeco influos la eksperimentajn rezultojn?
Q: Ĉu specimena stokado, eltiraj reakciiloj, inversa transskribaj reakciiloj kaj lumtranssendeblaj konsumaĵoj influos la eksperimentajn rezultojn?
Q: Kia metodo povas korekti la eksperimentajn datumojn?

Koncerne ĉi tiujn aferojn, ni priskribos ilin detale en la altnivelaj kaj altnivelaj sekcioj sube.
2. Altnivela scio

Koncerne al realtempa fluoreska kvanta PCR, ni devas rekoni la realecon, ke miloj da sciencaj esploraĵoj estas eldonitaj ĉiujare, inter kiuj la fluoreska kvanta PCR-teknologio ne estas malgranda nombro.

Se ne ekzistas komuna normo por mezuri la fluoreskan kvantan PCR-eksperimenton, la rezultoj povas varii vaste.Por la sama geno de la sama specio, kun la sama pretigmetodo, la detektrezultoj ankaŭ multe varias, kaj estos malfacile por malfruintoj ripeti la samajn rezultojn.Vi Neniu scias, kio estas ĝusta kaj kiu estas malĝusta.

Ĉu tio signifas, ke fluoreska kvanta PCR estas trompa teknologio aŭ nefidinda teknologio?Ne, estas ĉar fluoreska kvanta PCR estas pli sentema kaj pli preciza, kaj iom malĝusta operacio produktos tute kontraŭajn rezultojn.Malgranda perdo estas mil mejlojn for.La aŭtoro de la artikolo povas esti plurfoje torturita de la recenzistoj.Samtempe, la recenzistoj de la revuo ankaŭ malfacilas elekti el malsamaj eksperimentaj rezultoj.

Entute, montrante mankon de konsento en realtempaj PCR-eksperimentoj.Tiucele, altrangaj sciencistoj en la industrio komencis formuli normojn,postulante kontribuantojn provizi kelkajn necesajn eksperimentajn kaj datumajn detalojn (inkluzive de necesaj datumoj) en la artikolo por plenumi ĉi tiujn normojn.

Recenzistoj povas juĝi la kvaliton de la eksperimento legante ĉi tiujn detalojn;estontaj legantoj ankaŭ povas uzi ĉi tion por ripeti la eksperimenton aŭ plibonigi la eksperimenton.Tiam la eksperimentaj rezultoj akiritaj tiamaniere estas plenaj de informoj, altkvalitaj, kaj uzeblaj.

MIBBI (Minimuma Informo por Biologiaj kaj Biomedicinaj Esploroj -http://www.mibbi.org) estiĝis.MIBBI estas projekto kiu provizas normojn por eksperimentoj.Ĝi estas publikigita en naturo.Ĉi tiu projekto celas diversajn biologiajn eksperimentojn, inkluzive de ĉelbiologio, Microarray, qPCR, kiun ni diskutos nun, ktp., kaj provizas por ĉiu speco de eksperimento dum sendado de manuskriptoj.Tiuj informoj estu donitaj ĉiam.

En la projekto MIBBI, estas du artikoloj rilataj al fluoreska kvanta PCR, nome:
·RDML (Real-Time PCR Data Markup Language) - strukturita lingvo kaj raporta gvidilo por realtempaj kvantaj PCR-datumoj;
·MIQE (Minimumaj Informoj por Publikigo de Kvantaj Realtempaj PCR-Eksperimentoj) - minimumaj informoj por eldonado de artikoloj pri realtempaj kvantaj PCR-eksperimentoj.
Unue, ni parolu pri RDML, la terminologia specifo.

Se ne ekzistas norma difino por ĉio, estas neeble daŭrigi la diskuton, tial la klarigo de terminoj estas tiel grava en la ekzameno.
La terminologio uzita en la fluoreska kvanta PCR-eksperimento inkluzivas la sekvan enhavon.QIAGEN faris la plej bonan resumon por ni.La jenaj estas ĉiuj sekajvaroj .

Plifortiga kurbo
La plifortiga kurbo rilatas al la kurbo farita dum la PCR-procezo, kun la ciklonombro kiel la absciso kaj la realtempa fluoreskecintenseco dum la reago kiel la ordinato.

Bonega plifortkurbo devus havi la sekvajn karakterizaĵojn: la bazlinio estas plata aŭ iomete malpliigita, kaj ne estas evidenta suprena tendenco;la fleksia punkto de la kurbo estas klara, kaj la deklivo de la eksponenta fazo estas proporcia al la plifortiga efikeco.Ju pli granda la deklivo, des pli alta la plifortiga efikeco;la ĝenerala plifortiga kurbo La paraleleco estas bona, indikante ke la plifortiga efikeco de ĉiu tubo estas simila;la eksponenta fazo de la plifortiga kurbo de malaltaj koncentriĝaj specimenoj estas evidenta.

Bazlinio (Bazlinio)
La bazlinio estas la brunivelo de la frua ciklo, kutime mezurita inter la 3-a kaj 15-a ciklo, ĉar la fluoreska valoro pliiĝo kaŭzita de la plifortiga produkto ne povas esti detektita dum ĉi tiu periodo.La nombro da cikloj uzitaj por kalkuli la bazlinion povas esti varia kaj povas devi esti reduktita se altaj ŝablonkvantoj estas uzitaj aŭ se la esprimnivelo de la celgeno estas alta.

Fiksi la bazlinion postulas vidi fluoreskecdatenojn de la lineareca plifortiga kurbo.La bazlinio estas fiksita tiel ke la kresko de la plifortiga kurbo komenciĝas kun ciklonombro pli granda ol la bazliniocikla supra nombro.Bazlinioj devas esti fiksitaj individue por ĉiu celsekvenco.La mezaj fluoreskecvaloroj detektitaj en la fruaj cikloj devas esti subtrahitaj de la fluoreskecvaloroj akiritaj en la plifortigitaj produktoj.La plej novaj versioj de diversaj Realtempa PCR-programaro permesas aŭtomatan optimumigon de bazliniaj agordoj por individuaj specimenoj.

Dum la unuaj malmultaj cikloj de la PCR plifortiga reago, la fluoreskeca signalo ne multe ŝanĝas.Alproksimiĝi al rekta linio nomiĝas bazlinio, sed se ni atente rigardas la unuajn ciklojn, ni vidas, ke ene de la bazlinio estas kio okazas en la suba bildo.

Fono Fono rilatas al
la nespecifa fluoreskecvaloro en la reago.Ekzemple: malefika fluoreskeco estingo;aŭ granda nombro da duoble-senhelpaj DNA-ŝablonoj pro la uzo de SYBR Green.La fonkomponentoj de la signalo estas matematike forigitaj per la Real-Time PCR softvaralgoritmo.

Raportisto signalo
Raportisto-signalo rilatas al la fluoreska signalo generita per SYBR Green aŭ fluoreske etikeditaj sekvenc-specifaj enketoj dum Real-Time PCR.

Normaligita Raportisto-Signo (RN)
RN rilatas al la fluoreskecintenseco de la raportistfarbfarbo dividita per la fluoreskecintenseco de la pasiva referenca tinkturfarbo mezurita ĉe ĉiu ciklo.

Pasiva Referenca Tinkturo
En kelkaj Realtempaj PCR-oj,la fluoreska tinkturfarbo ROX estas uzata kiel interna referenco por normaligi la fluoreskan signalon.Ĝi korektas por varioj pro malpreciza pipetado, putopozicio, kaj fluoreskecfluktuoj sur puto-post-puto bazo.

La fluoreskeca sojlo (sojlo)
estis alĝustigita super la fona valoro kaj signife sub la altebenaĵa valoro de la plifortiga kurbo.Ĝi devas kuŝi en la linia regiono de la plifortiga kurbo, reprezentante la log-linian intervalon de PCR-detekto.Sojloj devus esti fiksitaj en la log-plifortiga kurbvido tiel ke la log-linia fazo de PCR estas facile identigebla.Se ekzistas multoblaj celgenoj en Real-Time PCR, la sojlo devas esti fiksita por ĉiu celo.Ĝenerale, la fluoreskeca signalo de la unuaj 15 cikloj de PCR-reago estas uzata kiel la fluoreskeca fonsignalo, kaj la fluoreskeca sojlo estas 10 fojojn la norma devio de la fluoreskeca signalo de la unuaj 3 ĝis 15 cikloj de PCR, kaj la fluoreskeca sojlo estas fiksita en la eksponenta fazo de PCR-amplifado.Ĝenerale, ĉiu instrumento havas sian fluoreskecsojlon fiksitan antaŭ uzo.

Cikla Sojlo (CT) aŭ Transirpunkto (CP)
La ciklo ĉe kiu la plifortiga kurbo transiras la sojlon (te, la punkto ĉe kiu fluoreskeca detekto pliiĝas signife).CT povas esti frakcio kaj la kvanto de komenca ŝablono povas esti kalkulita.La CT-valoro reprezentas la nombron da cikloj travivitaj kiam la fluoreska signalo en ĉiu PCR-reagtubo atingas la fiksitan sojlon.Estas linia rilato inter la CT-valoro de ĉiu ŝablono kaj la logaritmo de la komenca kopinombro de la ŝablono, lapli alta la komenca kopinombro, des pli malgranda la CT-valoro, kaj inverse.Normkurbo povas esti farita uzante normon kun konata komenca kopinombro, en kio la absciso reprezentas la CT-valoron, kaj la ordinato reprezentas la logaritmon de la komenca kopinombro.Tial, tiel longe kiel la CT-valoro de la nekonata specimeno estas akirita, la komenca kopinombro de la specimeno povas esti kalkulita de la norma kurbo.

ΔCT valoro
ΔCT-valoro priskribasla diferenco inter la celgeno kaj la ekvivalenta endogena referenca geno CT-valoro, kiel ekzemple mastruma geno, kaj estas uzata por normaligi la kvanton de ŝablono uzita:
⇒ΔCT = CT (cela geno) - CT (endogena referenca geno)

ΔΔCT Valoro
La ΔΔCT-valoro priskribas la diferencon inter la averaĝa ΔΔCT-valoro de specimeno de intereso (ekz., stimulitaj ĉeloj) kaj la averaĝa ΔΔCT-valoro de referenca provaĵo (ekz., nestimulitaj ĉeloj).La referencprovaĵo ankaŭ estas nomita la alĝustigprovaĵo kaj ĉiuj aliaj provaĵoj estas normaligitaj al tio por relativa kvantigo:
⇒ΔΔCT = meza ΔCT (specimeno de intereso) - meza ΔCT (referenca specimeno)

Endogenaj referencgenoj (endogenaj referencgenoj)
La esprimniveloj de endogenaj referencgenoj, kiel ekzemple mastrumaj genoj (mastrumaj genoj), ne malsamas inter provaĵoj.Kompari la CT-valorojn de la referenca geno al la celgeno permesas al la esprimnivelo de la celgeno esti normaligita al la kvanto de eniga RNA aŭ cDNA (vidu la sekcion pri ΔCT-valoroj supre).

Internaj referencaj genoj korektas porebla RNA-degenero aŭ la ĉeesto de enziminhibitoroj en RNA-provaĵoj, same kiel varioj en RNA-enhavo, inversa transskriba efikeco, nuklea acida reakiro, kaj provaĵmanipulado.Por elekti la optimuman referencan genon (j), ni modifis la algoritmon por permesi ĝian elekton de la optimuma referenco dependa de la eksperimenta agordo.

Interna kontrolo
Kontrolsekvenco kiu estas plifortigita en la sama reago kiel la celsekvenco kaj sondita per malsama enketo (t.e., elfarante duplex PCR).Internaj kontroloj ofte kutimas ekskludi malsukcesajn plifortigojn, kiel ekzemple kiam la celsekvenco ne estas detektita.
Ekzemplo de Kalibrado
Referenca provaĵo (ekzemple, purigita RNA de ĉellinio aŭ histo) uzita en relativa kvantigo por kompari ĉiujn aliajn provaĵojn por determini la relativan esprimnivelon de geno.La alĝustigprovaĵo povas esti ajna specimeno, sed estas kutime kontrolo (ekzemple, netraktita provaĵo aŭ provaĵo de tempo nul de la eksperimento).

Pozitivaj kontroloj
uzi kontrolreagojn kunkonataj kvantoj da ŝablono.Pozitivaj kontroloj ofte estas uzataj por kontroli, ke enkonduka aro aŭ enkonduka-sonda aro funkcias ĝuste kaj ke la reago estas agordita ĝuste.

Neniu Ŝablona Kontrolo (NTC)
Kontrola reago kiu enhavas ĉiujn necesajn komponentojn de la plifortiga reago krom la ŝablono, kiu estas kutime anstataŭigita per akvo.La uzo de NTC povas trovi la poluadon kaŭzitan de reakciaĵpoluado aŭ fremda DNA, tiel certigante la aŭtentecon kaj fidindecon de la detektaj datumoj.Plifortigo de la NTC-kontrolo indikas poluadon.

Neniu RT-kontrolo (NRT)
RNA-ekstraktadprocezo povas enhavi restan genoman DNA, kiu estas ekstreme damaĝa kaj estas la kulpulo influanta datenkvaliton kaj la naturan malamikon de qPCR, do dum dizajnado de eksperimentoj, ĝi devas esti dizajnita por nur plifortigi RNA-detekton.Estas du manieroj, unu estas desegni enkondukojn trans intronoj, la alia estas tute forigi DNA, kiu unu estas pli bona, kiu estos diskutita poste.La NTR-kontrolo estas magia spegulo por detekti DNA-poluadon.Se estas plifortigo, tio signifas, ke estas poluo.

Normoj
Normoj estas specimenoj de konata koncentriĝo aŭ kopinombro, kiuj estas uzataj por konstrui norman kurbon.Por certigi la stabilecon de la normo, la genfragmento estas kutime klonita en la plasmidon kaj utiligita kiel la normo.

La norma kurbo
estas kutime diluita en almenaŭ 5 koncentriĝajn gradientojn kun la norma produkto laŭ la duobliga proporcio, kaj 5 poentoj estas desegnitaj en la koordinatoj de CT-valoro kaj kopinombro, kaj la punktoj estas ligitaj por formi linion por generi norman kurbon.Por ĉiu norma kurbo, ĝia valideco devas esti kontrolita.La deklivvaloro falas inter –3.3 kaj –3.8, kaj ĉiu koncentriĝo estas farita triope.Punktoj kiuj estas signife malsamaj de aliaj punktoj devus esti forĵetitaj.La CT-valoro de la provaĵo estas alportita en la norman kurbon, kaj la esprimnivelo de la provaĵo povas esti kalkulita.

La CT-valoro de la provaĵo estas alportita en la norman kurbon, kaj la komenca kopinombro de la provaĵo povas esti kalkulita.

Efikeco kaj Deklivo
La deklivo de la norma kurbo reprezentas la efikecon de realtempa PCR.
·Deklivo de -3.322 indikas ke la PCR-amplifiga efikeco estas 1, aŭ 100% efika, kaj la kvanto de PCR-produkto duobliĝas ĉe ĉiu ciklo.
·Deklivo malpli ol –3.322 (ekz., –3.8) indikas PCR-efikecon
·Deklivo pli granda ol –3.322 (ekz., –3.0) indikas ke la PCR-efikeco ŝajnas esti pli granda ol 100%, kio estas scivolema, kiel unu ciklo de PCR povus generi pli ol duobligi la plifortigitan produkton?Ĉi tiu situacio okazas en la ne-linia fazo de la PCR-reago, tio estas, ekzistas granda kvanto de nespecifa plifortigo.

fandanta kurbo
Post kiam la qPCR-plifortigo estas kompletigita, la PCR-produkto estas varmigita.Dum la temperaturo altiĝas, la duoble-fadena plifortiga produkto iom post iom degelas, rezultigante malpliiĝon de fluoreskeca intenseco.Kiam certa temperaturo (Tm) estas atingita, granda nombro da produktoj fandiĝos.Fluoresko forte malpliiĝas.Malsamaj PCR-produktoj havas malsamajn Tm-valorojn kaj malsamajn degeltemperaturojn, tiel ke la specifeco de PCR povas esti identigita.

Fandanta kurbo (deriva kurbo)
La fanda kurbo estas derivita por formi pintmapon, kiu povas pli intuicie montri la situacion de PCR-produktaj fragmentoj.Ĉar la fandtemperaturo estas la Tm-valoro de la DNA-fragmento, iuj parametroj, kiuj influas la Tm-valoron de la DNA-fragmento, povas esti juĝitaj, kiel fragmento-grandeco, GC-enhavo, ktp. Ĝenerale, laŭ niaj komencaj dezajnaj principoj,la longo de la amplifita produkto estas en la intervalo de 80-300bp, do la fandtemperaturo devus esti inter 80 °C kaj 90 °C.

Interpreto de la fanda kurbo: Se la sola ĉefa pinto aperas inter 80°C-90°C, tio signifas, ke la fluoreska kvanta PCR estas perfekta;se la ĉefpinto aperas inter 80 °C-90 °C kaj diversaj pintoj aperas sub 80 °C, la enkonduka dimero estas baze konsiderata.Vi povas provi pliigi la tempan temperaturon por solvi ĝin;se la ĉefa pinto aperas inter 80°C-90°C, kaj la diversa pinto aperas denove kiam la temperaturo altiĝas, oni esence konsideras ke ekzistas DNA-poluado, kaj DNA devas esti forigita en la komenca etapo de la eksperimento.

Kompreneble, ankoraŭ ekzistas iuj nenormalaj situacioj, kiuj estos malkonstruitaj unuope sube.
3. Altnivela scio

Por fari qPCR, mi devas diri MIQE,Minimumaj Informojpor Publikigo deKvantaRealtempa PCREksperimentoj - la minimuma informo por eldonado de artikoloj pri realtempa kvanta PCReksperimentoj.Por simpligi ĉies komprenon, ni simpligos la ŝlosilan enhavon.

Vi povas serĉi la originalan tekston de MIQE en la Interreto, kaj la plej grava afero estas, ke ĝi kondiĉas ladatuma kontrolo, kiu devas esti provizita dum publikigado de artikolo .

Recenzistoj povas juĝi la kvaliton de la eksperimento legante ĉi tiujn detalojn;estontaj legantoj ankaŭ povas uzi ĉi tion por ripeti aŭ plibonigi la eksperimenton.
Indas noti, ke en ĉi tiu listo, la graveco de ĉiu listo estas markita respektive per E aŭ D.Kion ĝi signifas?E: esencaj informoj (devas esti senditaj);D: dezirinda informo (provizu kiel eble plej multe).

MIQE (1) - Eksperimenta Dezajno
Multaj friponoj, kiuj finis sian defendon post fino de siaj diplomiĝaj studoj, ne scios kiel desegni eksperimenton sendepende, malfermi siajn kajerojn kaj fari tion, kion la instruisto diras al ili.Kiel rezulto, la eksperimenta dezajno ne estis rigora, kaj la redakcio de la revuo diris, ke ili volas konsistigi ĉi tiun bildon kaj tiun bildon, do ili faris tion konsternite.Tiel fariĝas la friponoj!

Pli proksime al hejmo, la unua principo de la eksperimento estas determinila rigoro de la eksperimenta logiko.La plej fundamenta afero estas la eksperimenta dezajno, kaj la plej grava afero pri la eksperimenta dezajno estas kiel agordi la celspecon, referencan specimenon (kontrolo), kaj la nombron da ripetoj, tiel ke la eksperimentaj datumoj povas esti referencitaj, kompareblaj kaj konvinkaj.

La cela specimenorilatas al la specimeno, kiu postulas nin detekti la celgenon post certa traktado.La referenca specimenoestas la specimeno sen ajna traktado, kiu ofte estas referita kiel sovaĝa tipo en biologio.

Eksperimentaj kopiojestas tre gravaj.Ĝenerale, la nombro da konvinkaj kopioj devas esti pli ol tri.Estas necese distingi kio estas biologia reproduktado kaj kio estas teknika reproduktado.

Biologiaj Reproduktaĵoj: La sama kontrola eksperimento farita kun malsamaj materialoj (tempo, plantoj, aroj, reagplatoj).

Biologia duobligo
Ni prenu la insekticidan traktadon de pipro kiel ekzemplon.Ni volas ŝpruci insekticidojn sur la tri plantojn de ABC, tiam la tri plantoj de ABC estas tri biologiaj kopioj, kaj ili estas la sama kontrola eksperimento farita kun malsamaj materialoj.Sed kiel eksperimento oni certe bezonas kontrolon, do ni povas ŝprucigi unu el la branĉoj de planto A por formi eksperimentan grupon de planto A, kaj ne ŝprucigi la aliajn branĉojn de planto A por formi kontrolgrupon.Faru la samon por B kaj C.

Teknikaj Reproduktaĵoj (Teknikaj Reproduktaĵoj): Ĝi estas ripeta eksperimento desegnita por eviti erarojn kaŭzitajn de operacio, kiu fakte estas duplikata truo inkluzivita en la sama materialo.Kaj traktadoj kaj kontroloj devas havi kopiajn agordojn (minimume tri) de la celgeno kaj la interna referenca geno.

Teknika ripeto
Prenu denove la pipron traktitan per pesticidoj kiel ekzemplon.Por la eksperimenta grupo de planto A, ni faris tri PCR-truojn de 1, 2 kaj 3 por ĝia celgeno kaj interna referenca geno respektive, por preni la mezumon post la detekto.Por la kontrolo de planto A Grupoj ankaŭ estas traktataj en la sama maniero.Simile, faru la saman traktadon por B kaj C plantoj.Ĉi tio estas teknika ripeto.

Indas rimarki tionkio eniras la statistikon estas la biologia ripeto, kaj la teknika ripeto estas provi ĉu ekzistas hazardaj fenomenoj en la eksperimenta procezo, por fari la eksperimentajn rezultojn kredindaj, tio estas, por eviti erarojn prenante ilian mezumon kiel ni ofte diras.

Negativaj Kontroloj - NTC kaj NRT
NTC (Ne-Ŝablona Kontrolo), kontrolo sen ŝablono, estas uzata por kontroli ĉu la eksperimenta materialo estas poluita.Ĝenerale, akvo estas uzata kiel ŝablono.Se ekzistas fluoreska reago, ĝi indikas ke nuklea acida poluado okazis en la laboratorio.

Ĉi tiuj poluoj venas de: malpura akvo, nekvalifikitaj reakciiloj enhavantaj endogenan DNA, primerpoluado, laboratoria ekipaĵopoluado, aerosolpoluado, ktp., bezonas uzi RNase-kadavrojn kaj RNase-inhibintojn.Aerosolpoluo estas la plej malfacile trovebla.Imagu, ke via laboratorio estas kiel nebulo, kun diversaj nukleaj acidoj suspenditaj en la aero.

NRT (Ne-Inversa Transskribazo), la kontrolo sen inversa transskribo, estas la ne-inversa transskribita RNA kiel negativa kontrolo, kio estas la kontrolo de gDNA-restaĵo.

Dum farado de genekspresio, la kvanto de RNA estas detektita detektante la kvanton de cDNA post inversa transskribo.Se estas gDNA-restaĵo kiam RNA estas purigita, ĝi kaŭzos erarojn en la eksperimentaj rezultoj, ĉar la realaj rezultoj akiritaj estas gDNA kaj cDNA.Sur la entuta nivelo, ne nur cDNA, gDNA devas esti tute forigita dum RNA-ekstraktado.

MIQE (2)—ekzempla informo
La tiel nomataj specimenaj informoj signifas, ke kiam ni publikigas artikolon pri qPCR, ni devas klare klarigi la specimenajn informojn, kio estas nemalhavebla parto de la artikolo.Simile, kiam ni prilaboras specimenojn, ni ankaŭ devas reguligi niajn proprajn operaciojn por certigi la validecon de la specimenoj.

La priskribo de la specimeno estas nur rezulto, kaj ni pli atentu la materialojn prenitajn dum la tuta eksperimento.

Selektado de eksperimentaj materialoj
Sangaj specimenoj - elektu freŝan sangon, ne pli ol 4 horojn.Ĉelprovaĵoj - elektu kolekti freŝajn ĉelojn en periodo de vigla kresko.Besta histo - Elektu freŝan, vigle kreskantan histon.Planta histo - Elektu freŝan, junan histon.

Vi certe rimarkis, ke estas ŝlosilvorto en ĉi tiuj malmultaj frazoj: freŝa .
Por ĉi-supraj specimenoj, la plej bona, kostefika kaj stabila ilaro sur la merkato estas la ilaro de Foregene, kiu povas rapide kaj facile ĉerpi ilian DNA kaj RNA.

Blood DNA Mini Kit

Ĉela Totala RNA-Izola Ilaro

Besta Totala RNA-Izola Ilaro

Plant Totala RNA-Izola Ilaro

Plant Total RNA Isolation Kit Plus

Plant DNA-Izola Ilaro

Stokado de eksperimentaj materialoj
Ĝenerale, ni ne rekomendas konservi specimenojn, se la kondiĉoj permesas.Tamen estas multaj amikoj, kiuj ne povas fari eksperimentojn tuj post specimenigo, kaj iuj eĉ bezonas porti likvajn nitrogentankojn al la kampo por specimenigo.

Por ĉi tiu speco de laborema amiko, mi povas nur diri, ke vi ne komprenas reaktivajn konsumaĵojn.Nun multaj kompanioj de konsumeblaj reakciiloj produktas reakcilojn, kiuj povas stoki RNA-provaĵojn ĉe ĉambra temperaturo, kaj vi povas elekti uzi ilin.La konvencia stokado-metodo estas likva nitrogena stokado, uzante malgrandan likvan nitrogentankon, kiu estas facile portebla.Reportinte la specimenon al la laboratorio, konservu ĝin en fridujo de -80 °C.

Por eksperimentoj implikantaj RNA, la sesvorta principo devas esti sekvita:malalta temperaturo, sen enzimoj,kajrapida .

La koncepto de malalta temperaturo estas facile komprenebla;sen enzimoj, RNazo estas ĉie en la mondo en kiu ni vivas (alie vi estus mortigita de HIV), do kiel eviti RNazon dum eksperimentoj estas tre grava koncepto;rapida,Ne ekzistas Kung Fu en la mondo, kiu ne povas esti rompita, nur rapideco ne povas esti rompita.

Sekve, iusence, ju pli mallonga estas la eltira tempo, des pli bona la ilaro.Kial farasAntaŭgenoLa ilaro de 's emfazas rapidecon, ĉar ili bone konas ĝin.

PS: Kelkaj knabinoj faras eksperimentojn tre zorge, sed ili ne estas tiel bonaj kiel slam dunk post pluraj jaroj da laboro.Ili sentas, ke Dio estas maljusta, plendas pri aliaj, kaj serĉas vivon.Fakte, ŝi ne komprenis ĝin.Li ne bone protektis la RNA, kaj la slamdunk ludanto estis facilmova.Kiam li estis faranta la eksperimenton, li pensis ke li finos la slam dunk kun tri fojojn, kvin fojojn kaj du sekcioj, sed li faris la eksperimenton bone.

Notu: Pli malrapide, pli da ŝancoj de RNase-invado.Kiel trejni vin por esti rapida?Ne estas maniero, nur praktiku pli.

Por malsamaj eksperimentoj kaj malsamaj specimenoj, ankoraŭ necesas legi pli da literaturo kaj elekti taŭgan metodon por prilaborado.Por la specimena kolekto kaj konservado procezo, MIQE postulas, ke ĝi devas esti klare skribita en la papero, por ke la recenzistoj povu revizii la fidindecon de la papero, kaj estas ankaŭ oportune por la miregigitaj junuloj ripeti vian eksperimenton.

Kvankam biologiaj eksperimentoj estas malfacilaj, ili estas altnivelaj.Se vi ne zorgas, vi povas renversi la mondon.Ekzemple, transformi SARS en biokemian krizon, aŭ fari hibridan rizon por savi 1,3 miliardojn da homoj.La suba bildo estas kemia eksperimento, vi devus kompreni kiom fiera vi estas pri via esplorado nur rigardante lian dik-similan aspekton.Forgesu ĝin, ne nigrigu lin.

MIQE (3) - eltiro de nuklea acido.
Nukleacida eltiro estas granda evento, kaj ĉiuj molekula biologiaj eksperimentoj komenciĝas per nukleaacida eltiro.Antaŭ ĉio, ni kopiu la enhavon de MIQE pri nuklea acida eltiro.

Rigardante ĉi tiun formon, vi ne povas resti sur la surfaco.La formo estas dogmo.Por esti plej alta studento, vi devas demandi kial.La esenca enhavo de ĉi tiu tabelo estas: Sekvula pureco, integreco, konsistenco, kaj ekstrakta kvanto de RNA .

La unua parto de laprocezo aŭ instrumento estas la eltira paŝo de nuklea acido.Se vi uzas aŭtomatan ĉerpilon por ĉerpi (altnivele, bonvolu kontakti min por aĉeto), vi devas indiki la modelnomon de la instrumento.

La nomo de la ilaro kaj

kia ilaro estis uzata por la ŝanĝaj detaloj, kiaj specialaj reakciiloj estis aldonitaj aŭ kiaj specialaj operacioj estis faritaj, estu klare klarigitaj, por ke aliaj povu facile ripeti vian eksperimenton.

Iuj homoj aldonas iujn specialajn reakcilojn ĉerirante specialajn specimenojn, opiniante, ke tio estas ilia sekreta armilo kaj ne diras al aliaj.Tenante ĝin sekreta, ili ankaŭ perdas la ŝancon fari vian artikolon brili.Ne estu lerta, vi devas esti pli honesta ol la landa maljuna Zhang en scienca esplorado, se vi volas esti lerta, la artikolo igos vin stulta.

devas memori la produktan numeron de la ilarokiam vi mendis la ilaron kaj verkas la artikolon.Ĝenerale estas du nombroj sur la ilaro: Kato - katalogo-numero (produkta numero, artikolnumero), Loto - produkta lotnumero (Uzita por indiki de kiu aro venis la produkto).

Krome, la CAS-numero estas ofte uzata dum mendado de biokemiaj reakciiloj, kaj mi popularigos ĝin kune.La CAS-numero estas la nombro donita de la American Chemical Society al ĉiu nova kemia drogo.Ĝenerale, tri nombroj estas ligitaj per streketo.CAS-numero de Rushui: 7732-18-5.Kemiaĵoj ofte havas multoblajn kaŝnomojn, sed la CAS-nombro estas unika.Mendante medikamenton, vi povas unue kontroli ĝian CAS-numeron.

Pli proksime al hejmo, kial ni devas klare priskribi ĉi tiujn aferojn?Fakte, ĝi ankaŭ estas kontroli la kvaliton de RNA-eltiro.La uzo de instrumentoj kaj ilaroj igos RNA-ekstraktadon pli konsekvenca.La eltira skalo de ordinaraj laboratorioj ne estas granda, kaj ĝi povas esti akirita per ilaroj.

La detaloj de DNase aŭ RNase-traktado
La grava afero de fluoreska kvanta PCR estas malhelpi DNA-poluadon, kaj ne eksperimenti se ekzistas poluado.Tial, estas necese deklari la procezon, kiun vi uzis por prilabori la DNA, por pruvi, ke la DNA en la eksperimenta procezo estis tute kaj tute forigita.reprezentita per skema diagramo.

Skema diagramo de RNA kaj DNA
Ĝenerale, la metodo por forigi DNA estas trakti RNA kun DNase post eltiro.Tamen, ĉi tiuj estas relative malnovaj metodoj.Komercaj RNA-ekstraktadkompletoj povis forigi DNA dum la ekstraktadprocezo sen aldoni DNase.Ekzemple, serio de kits de Foregene.

Notu: Forigi DNA dum RNA-eltiro estas tre danĝera dutranĉa glavo, kiu plilongigos la operaciotempon de RNA-eltiro kaj pliigos la riskon de RNA-degenero.Esence, ĝi estas kompromiso inter RNA-rendimento kaj pureco.

Krome, la kvanto de DNase aldonita al la silik-bazita adsorba kolumno estas tre malgranda, kaj altkvalita DNase devas esti uzata por atingi la efikon.Neoptimumigita DNase ne povas esti digestita rapide kaj tute.Ĉi tio estas provo de la teknika nivelo de la komercisto.Kompreneble, estas eĉ pli strangaj komercistoj, kiuj fanfaronas, ke DNA povas esti forigita sen DNase.Oni povas diri, ke ĉiu, kiu fanfaronas, ke DNA povas esti tute forigita sen DNase, estas huligano.DNA estas relative stabila dufadena strukturo, kaj ĝi ne povas esti forviŝita nur per parolado kaj ridado.

Takso de poluado
taksa metodo: elektroforez-detekto, 1% agarozo, 6V/cm, 15min, ŝarĝo 1-3 ul

Kvanta analizo de nuklea acido
estas kutime mezurita per UV-spektrofotometro.Mi unue popularigu la signifon de la tri valoroj de OD260, OD280 kaj OD230.
·OD260nm: Ĝi estas la sorba ondolongo de la plej alta sorba pinto de nuklea acido, kaj la plej bona mezurita valoro varias de 0,1 ĝis 1,0.Se ne, diluu aŭ koncentru la specimenon por alporti ĝin ene de intervalo.
·OD280nm: Ĝi estas la sorba ondolongo de la plej alta sorba pinto de proteinoj kaj fenolaj substancoj.
·OD230nm: Ĝi estas la sorba ondolongo de la plej alta sorba pinto de karbonhidratoj.

Poste, ni parolu pri la rolo de ĉiu indikilo.Por A260, ĝi povas esti uzata por mezuri la rendimenton de nuklea acido.Kiam OD260=1, dsDNA=50μg/ml, ssDNA=37μg/ml, RNA=40μg/ml.

Por pureco, ni devas rigardi la proporciojn, kiujn ni kutime vidas: OD260/280 kaj OD260/230.
·Pura DNA: OD260/280 estas proksimume egala al 1.8.Kiam ĝi estas pli granda ol 1.9, ĝi indikas ke ekzistas RNA-poluo, kaj kiam ĝi estas malpli ol 1.6, ĝi indikas ke ekzistas proteino kaj fenolpoluo.
·Pura RNA: 1.7
·OD260/230: Ĉu ĝi estas DNA aŭ RNA, la referenca valoro estas 2,5.Kiam ĝi estas malpli ol 2.0, ĝi indikas, ke estas poluado de sukero, salo kaj organika materio.

RNA integreco

Estas tre grave mezuri la integrecon de RNA.Ĝenerale, necesas fari RNA-malnaturan ĝelan eksperimenton por kontroli ĉu la brileco inter 28S kaj 18S RNA estas duobla rilato.Kiam la tria bando 5S aperas, tio signifas, ke la RNA komencis degradi, krom senvertebruloj.

Datenoj por RNA-kvalita taksado: Krom ĉi-supraj testoj, ekzistas ankaŭ kelkaj pli altnivelaj instrumenttestoj laŭ RNA-integreco, kiel ekzemple la RQI-integrectesto de la aŭtomata elektroforezsistemo Experion, kiu povas detekti ĉu RNA estas degradita nevideble.

En scienca esplorado, fluoreska kvanta PCR estas komparo inter la celgeno kaj la interna referenca geno.Tial, en la procezo de konservado de specimeno de RNA, eltiro de RNA ktp., la ĉefa celo estas certigi la integrecon de RNA.

Kiel la integreco de RNA influas la ekvilibron inter la celgeno kaj la interna referenca geno povas esti facile komprenita de la figuro malsupre.Degradiĝo kondukos al gena nekompleteco, ĉu ĝi estas la nekompleteco de la interna referenca geno aŭ la nekompleteco de la cela geno, ĝi havos grandan efikon al la datumoj.

Skema diagramo de celgeno kaj referenca geno, devas ne esti vera

Inhibicia testo (ĉu la CT-valoro estas subpremita sub alta aŭ malalta koncentriĝo aŭ aliaj kondiĉoj)

Prenante ĉi tiun figuron kiel ekzemplon, la Ct-valoroj de la kvin kurboj estas kiel sekvas.La distribuado de CT-valoroj inter la kurboj estas neegala, kaj la Ct-valoroj estas prokrastitaj sub altaj kaj malaltaj koncentriĝoj, kio estas la kazo de PCR-inhibicio.

Ŝlosila punkto: En la procezo de RNA-eltiro, ni devas forlasi miskomprenojn kaj establi ĝustajn.

La malĝusta ideo estas: RNA-eltiro nur persekutas la rendimenton, opiniante, ke ju pli granda la kvanto de RNA akirita, des pli bone.Fakte, kiam ni faras kvantigon, se la nombro da genoj ne estas tre granda, ni ne bezonas multe da RNA.La kvanto de RNA kiun vi eltiras estas pli ol sufiĉa.

La ĝusta koncepto estas:RNA-ekstraktado devus trakti purecon, integrecon kaj konsistencon.Pureco povas certigi ke la posta inversa transskribo ne estas malhelpita kaj la datenoj ne estos trafitaj per DNA.Integreco certigas la ekvilibron de celsekvencoj kaj internaj referencoj.Konsistenco certigas stabilan specimenan ŝarĝon.

MIQE (4) – inversa transskribo
Miskompreniĝo: la postkuro de pli alta specimena volumo.
Ĝusta koncepto: Sekvu konsistencon (stabilecon), sendepende de la kvanto de RNA ŝarĝita, la efikeco de inversa transskribo restas konsekvenca, certigante ke diferencoj en cDNA povas vere reflekti diferencojn en mRNA.
Ni klarigas ĉi tiun procezon per skema diagramo:

Skema diagramo de inversa transskriba efikeco, ne estas vera
Antaŭ ĉio, ni devas kompreni la diferencon inter la inversa transskriba procezo kaj la PCR-procezo.PCR spertas multoblajn hejtajn kaj kalcigajn procezojn, kaj la celfragmento kreskas eksponente;dum inversa transskribo ne havas ĉi tiun procezon, ni povas imagi, ke inversa transskribo estas efektive unu-al-unu Dum la reproduktadprocezo, tiom da pecoj de RNA

kiel ekzistas povas ricevi tiom da pecoj de cDNA Informoj, ĝi devus esti komprenita nun, ĉar fragmentoj grandaj kaj malgrandaj estis inverse transskribitaj, kaj estas neeble koncentriĝi sur unu fragmento.Kaj ĉar la kvanto de RNA estas relative malgranda, la kvanto de cDNA akirita ankaŭ estas relative malgranda, male al PCR, kiu havas plifortigan efikon, do ĝi estas esence neeble detekti.

cDNA elektroforezrezultoj
Due, ideale, inversa transskribo estas farita unu-al-unu, sed neniu inversa transkriptazo de iu kompanio povas atingi ĉi tiun efikon.Esence, la efikeco de la plej multaj inversaj transkriptazoj vagas inter 30-50%.Se ĉi tio estas la kazo, ni prefere havus relative stabilan inversan transskriban efikecon, kio estas kion ni volas vidi en la figuro: 3 RNA-oj ricevas 2 cDNA-ojn, 6 RNA-oj ricevas 4 cDNA-ojn, do kiom ajn specimeno estas ŝarĝita, la inversa transskriba efikeco estas relative stabila.Ni ne volas vidi la situacion kie inversa transskriba efikeco estas malstabila kaj alta koncentriĝo estas malhelpita.

Do, kiel kontroli ĉu la inversa transskriba efikeco estas stabila?La metodo estas tre simpla, vi nur bezonas fari komparan teston: unu estas inversa transskribi al cDNA post duobla diluo de RNA, kaj la alia estas fari duoblan diluon post inversa transskribado al cDNA, kaj poste fari qPCR por vidi la akiritan deklivon Ĉu ĝi estas konsekvenca.Kiel plej alta studento, vi devus kompreni ĝin en sekundoj.Kiel montrite sube:

Diluo de RNA kaj cDNA por testi ĉu la efikeco de inversa transskribo estas stabila
Inversa transskribazo kaj ilaro
Kiel povas perfekta fluoreska kvanta PCR havi bonegan inversan transkriptazon kaj ilaron.Inversa transkriptazo estas malglate dividita en du tipojn laŭ la fonto, AMV aŭM-MLV, kaj ilia agado estas la sama kiel tiu montrita en la tabelo.

Agado de RNase H
RNase H estas Ribonuclease H, la ĉina nomo estas ribonuclease H, kio estas endoribonuclease kiu povas specife hidrolizi RNA en la DNA-RNA hibrida ĉeno.RNazo H ne povas hidrolizi la fosfodiesterajn ligojn en unu-fadena aŭ duoble-fadena DNA aŭ RNA, tio estas, ĝi ne povas digesti ununuran aŭ duoble-fadenan DNA aŭ RNA.Ofte uzata en la sintezo de la dua fadeno de cDNA.

Estas stranga afero.Ni diras, ke inversa transkriptazo havas RNase H agadon, ne ke inversa transkriptazo enhavas RNazon H, kaj eble ne eblas apartigi RNase H de inversa transkriptazo, eble pro la formo de certaj grupoj en inversa transkriptazo. Ĉi tiu agado estas kaŭzita de la inversa transkriptazo.

Tial, nekonsiderante la pli alta inversa transskriba efikeco de AMV, ĝia RNase H-agado reduktas la rendimenton de cDNA.Kompreneble, reakciigproduktantoj konstante optimumigas siajn produktojn por forigi RNase H-agadon en inversa transkriptazo kiel eble plej multe por pliigi la rendimenton de cDNA.
Kuracia temperaturo

Sekundara strukturo de RNA ĉe malsamaj temperaturoj
Vidu la figuron supre por la sekundara strukturo de RNA ĉe malsamaj temperaturoj, kaj uzu la retan ilon mFold por determini la sekundaran strukturon de la celfragmento sub specifaj temperaturoj kaj salaj koncentriĝkondiĉoj.Je 55 °C, la sekundara strukturo de la RNA estas ankoraŭ tre kompleksa, inversa transkriptazo ne povas funkcii, kaj la sekundara strukturo ne povas esti tute solvita ĝis 65 °C, dum la optimuma temperaturo de AMV kaj M-MLV estas multe pli malalta ol tiu temperaturo.
kion fari?La sekundara strukturo estas la komplementa parigo de la ŝablono mem, kiu kondukas al forta konkurado inter la enkonduko kaj inversa transkriptazo kaj la ŝablono, rezultigante serion de problemoj kiel ekzemple malalta E kaj malbona ripeteblo.

kion fari?Nur pliigu la temperaturon de recocido kiel eble plej multe.

Multaj reakciigproduktantoj plibonigas sian inversan transkriptazon per genetika inĝenierado.Kelkaj pliigas la reagtemperaturon, kiel ekzemple Jifan kaj Aidelai, kaj kelkaj forigas la aktivan grupon de RNase H-enzimo por plibonigi la afinecon inter la enzimo kaj la RNA-ŝablono.Alta afineco povas konkurenci elpremi la sekundaran strukturon kaj tralegi glate, kaj ankaŭ multe plibonigi la efikecon de inversa transskribo.
Ŝlosila punkto: Inversa transskribo estas pli grava por trakti la konsistencon de inversa transskriba efikeco (enzimoj devas ne nur esti efikaj sed ankaŭ stabilaj), prefere ol la kvanto de specimeno ŝarĝita, se ĝi ne estas precipe grandskala fluoreska kvanta PCR, ĝi ne estos ebla entute.Multoblaj cDNAoj.
Diversaj produktantoj ankaŭ faris kelkajn klopodojn en la serĉado de konsistenco.Ekzemple, plej multaj kompanioj nun pakis inversan transskribon kiel norman ilaron por vendo, kio estas bona elekto.
Ekzemple, la ilaroj RT Easy Series de Foregene:

RT Easy I (Mastra antaŭmiksaĵo por unua fadena cDNA-sinteza ilaro)

MIQE (5) - celaj geninformoj

La supra figuro klarigas
1. Ĉu ĉi tiu geno estas efika por ripetaj eksperimentoj ĝenerale povas esti kontrolita per ripetaj eksperimentoj.
2. Gene ID, vi scias.
3. Genlongo, la totala longo de la cela geno estas sendube neniu problemo.Dum desegnado de enkondukoj, certigu, ke la longo de la amplikono estas inter 80-200bp por certigi pli bonan plifortan efikecon.
4. Sequence Blast kompara informo, la cela geno devas esti komparita en genbanko por malhelpi nespecifan plifortigon.
5. Ĉeesto de pseŭdogenoj.Pseŭdogeno estas DNA-sekvenco simila al normala geno sed perdas sian normalan funkcion.Ĝi ofte ekzistas en la plurgena familio de eŭkariotoj.Ĝi estas kutime reprezentita per ψ.Ĝi estas ne-funkcia genoma DNA-kopio en la genaro kiu estas tre simila al la kodiga gensekvenco., estas ĝenerale ne transskribitaj, kaj havas neniun klaran fiziologian signifon.
6. Pozicio de enkondukoj rilate al eksonoj kaj intronoj.En la fruaj jaroj, kiam ni solvis la problemon de DNA-poluado, ni ofte atentis la poziciojn de enkondukoj, eksonoj kaj intronoj, kaj ĝenerale pripensis dizajni enkondukojn trans intronoj por eviti DNA-plifortigon.Bonvolu vidi la figuron malsupre: nigra reprezentas intronojn, diversaj bluoj reprezentas eksonojn, rozkolora reprezentas oftajn enkondukojn, kaj brilruĝa reprezentas intron-kovrantajn enkondukojn.

Skema, neniam vera
Kia perfekta plano ĉi tio ŝajnas, sed fakte, en la plej multaj kazoj, la trans-intronaj enkondukoj ne estas tiel magiaj kiel imagite, kaj ili ankaŭ kaŭzos nespecifan plifortigon.Do la plej bona maniero malhelpi DNA-poluadon estas tute forigi DNA.
7. Konforma prognozo.Uzante ĉi tiun ekzemplon denove, uzu la interretan ilon mFold por determini la sekundaran strukturon de la cela fragmento ĉe specifa temperaturo kaj salokoncentriĝo.

Sekundara strukturo de RNA ĉe malsamaj temperaturoj
La sekundara strukturo estas la komplementa parigo de la ŝablono mem, kiu kondukos al forta konkurado inter la enkonduko kaj ŝablonpariĝo, kaj la ŝancoj de enkonduka ligado estas malpli, rezultigante serion de problemoj kiel ekzemple malalta E kaj malbona ripeteblo.Per programara prognozo, se ne ekzistas sekundara strukturproblemo, tio estus bonega.Se ekzistas, nia sekva artikolo specife diskutos kiel solvi ĉi tiun problemon.

MIQE (6) - qPCR Oligonukleotidoj

Por fluoreska kvanta PCR, la unua afero kun kiu vi luktas ĉiutage estas RNA-ekstraktado, kaj la dua afero povas esti enkonduka dezajno.
Antaŭ ĉio, ni ankoraŭ kontrolas la regulojn pri enkonduka dezajno laŭ la MIQE-kontrollisto.Ĝi estas tiel simpla, ke la friponoj povas ridi, kaj ni povas fini ĝin per unu frazo: eltrovu la sinsekvon kaj pozicion de la primer-sondilo kaj la modifa metodo.Por la metodo de purigado de enkonduko, la sintezo de unua sintezo estas tiel malmultekosta nuntempe, qPCR indas je PAGE kaj supre purigaj metodoj, kaj la informoj de la sinteza instrumento ne gravas.Multaj homoj faras enkondukojn dum jardekoj kaj ne scias, ke la sintezilo estas ABI3900.
Koncerne la principojn de enkonduka desegno, vi ne devas memore enmemorigi ilin, ĉar la plej multaj unuaj dezajnaj programaroj aŭ interretaj iloj povas prizorgi ĉi tiujn problemojn (rekomendita interreta ilo primer3.ut.ee/), kaj 99,999% de enkonduka desegno ne estas farita permane Rigardu, la aŭtoro foje desegnas centojn da enkondukoj tage, se vi legas unu post la alia, ĝi fariĝos kruca.
Nur kontrolu la sekvajn punktojn post kiam la enkondukoj estas desegnitaj:
1. Dezajnu enkondukojn proksime al la 3′ fino: En la kazo de uzado de oligo dT enkondukoj por cDNA unua-fadena sintezo, konsiderante la inversan transskriban efikecon kaj RNA-integrecon, la desegnitaj enkondukoj devas esti desegnitaj proksime al la 3′ fino por plibonigi plifortigan efikecon.Uzu bildon por klarigi jene (ne ekzistas maniero kompreni ĉi tion):

Kial enkondukoj devus esti desegnitaj proksime al la 3′ fino, ĝi ne devas esti vera
2. TM-valoro: La Tm-valoro estas je 55-65 °C (ĉar la eksonukleaza agado estas la plej alta je 60 °C), kaj la GC-enhavo estas je 40%-60%.
3. BLAST: Por eviti nespecifan plifortigon de la genaro, Blast devas esti uzata por suplementa konfirmo.

MIQE(7) - qPCR-procezo

1. qPCR-kompleto
Laŭ la postuloj de MIQE, ni devas klare priskribi la kompletajn reagkondiĉojn en la artikolo, inkluzive de la agordo de la PCR-reaga sistemo, kia ilaro estas uzata, kiu estas la fabrikanto, kiom granda estas la reagsistemo, ĉu la tinktura metodo aŭ la enketmetodo estas uzata, PCR-programa agordo.Veteranaj ŝoforoj certe trovos, ke kondiĉe ke la ilaro estas elektita, la supraj informoj estas esence determinitaj.
Nuntempe, la fabrikado kaj produktado de fluoreskaj kvantaj PCR-kompletoj estas tre matura teknologio.Dum vi ne elektas ekstreme malbonajn fabrikistojn, la probablo de problemoj ne estas alta, sed ni ankoraŭ volas dividi kun vi kelkajn punktojn:
Varmega Taq-enzimo:La plej grava parto de PCR estas la varmega Taq-enzimo.La varma-komencaj enzimoj sur la merkato estas ĝenerale dividitaj en du tipojn, unu estas kemie modifita varma-komenca enzimo (vi povas imagi ĝin kiel parafina enkonstruado), kaj la alia estas varma-komenca enzimo por antikorpa modifo (antigen-antikorpa ligado).Kemia modifo estas frua maniero de varmegaj enzimoj.Kiam certa temperaturo estas atingita, la enzimo liberigos sian agadon.La antikorp-modifita varma-komenca enzimo uzas biologiajn metodojn por bloki la agadon de la enzimo.Kiam certa temperaturo estas atingita, la antikorpo estos denaturigita kaj malaktivigita kiel proteino, kaj la enzima aktiveco estos alportita en ludon.

Tamen, por kio ĉi tio utilas?Ĉi tiu estas la kazo, la liberiga agado de antikorp-modifitaj enzimoj estas pli rapida ol tiu de kemie modifitaj enzimoj, do laŭ sentemo, antikorp-modifitaj enzimoj havas etan avantaĝon, tiel ke esence ne estas kemie modifitaj enzimoj en la ilaroj sur la merkato.Se ekzistas, tiam la teknologio de ĉi tiu fabrikanto ankoraŭ estas blokita en la epoko de la jarmilo.
Koncentriĝo de magneziojono:Magneziojonkoncentriĝo estas tre grava en la PCR-reago.Taŭga magneziojonkoncentriĝo povas antaŭenigi la liberigon de Taq-enzima aktiveco.Se la koncentriĝo estas tro malalta, la enzima aktiveco estos signife reduktita;se la koncentriĝo estas tro alta, la enzim-katalizita nespecifa plifortigo estos plifortigita.La koncentriĝo de magneziojonoj ankaŭ influos la kalson de enkondukoj, la fandan temperaturon de la ŝablono kaj PCR-produktojn, tiel influante la rendimenton de plifortigitaj fragmentoj.La koncentriĝo de magneziojonoj estas ĝenerale kontrolita ĉe 25mM.Kompreneble, por bona ilaro, la koncentriĝo de magneziojonoj devas esti bone kontrolita.Iuj komercistoj aldonas kelatan agenton de magnezio-jono al la reakciilo, kiu povas atingi la efikon de aŭtomata alĝustigo de la koncentriĝo de magnezio-jono.
Fluoreska tinkturfarba koncentriĝo:Fluoreska tinkturfarbo, kiu estas la SYBR-Verdo, kiun ni kutime uzas, ĉefe generas fluoreskecon per ligado al la negrava sulko de duoble-fadena DNA, ĉar la ligado de la tinkturfarbo al duoble-fadena DNA estas nespecifa, t.e. Dum duoble-fadena DNA estas kombinita kun ĝi, fluoreskeco povas okazi, do primer-dimeroj kaj fono-signaloj kombinos ĝin en la sistemo de DNA-ŝablonoj.
PS: Pro ĝiaj lum-sentemaj propraĵoj, produktoj sur la merkato estas ĝenerale pakitaj en brunaj maldiafanaj centrifugilaj tuboj (kiel montrite en la bildo sube).Tamen, ĉi tio renkontos problemon.Estas malfacile vidi ĉu la likvaĵo estas suĉita dum provado.Ĉi-rilate, Qingke estas ja la plej uzebla (kiel montrita en la bildo sube), kaj la travidebla tubo estas pakita en maldiafana stana sako.Poste metu ĝin en ladan sakon, konsiderante la oportunon eviti lumon kaj specimenigon.Vi devas elekti la ĝustan produktan numeron.TSE204 estas superkoste efika ekzisto, kiu igas min deziri planti herbon.

La koncentriĝo de la fluoreska tinkturfarbo ankaŭ estas tre grava.Se la koncentriĝo estas tro malalta, la plifortiga kurbo ne iros supren en la pli posta stadio kaj ne estas perfekta;se la koncentriĝo estas tro alta, ĝi kaŭzos bruan interferon.Ĉar la fluoreska kvanta PCR plejparte dependas de la CT-valoro, se la koncentriĝo de la fluoreska tinkturfarbo ne estas ĝustigita, la malalta punkto estas pli bona ol la alta punkto.Kompreneble, la taŭga tinktura koncentriĝo estas la plej bona.

ROX: ROX-tinkturfarboj estas uzataj por korekti bon-al-bone fluoreskecaj signaleraroj.Kelkaj instrumentoproduktantoj postulas alĝustigon, dum aliaj ne faras.Ekzemple, la uzo de la realtempa PCR-amplifilo de Thermo Fisher Scientific kutime postulas kalibradon, inkluzive de 7300, 7500, 7500Fast, StepOnePlus, ktp. La ĝeneralaj instrukcioj priskribos ĝin.
La qPCR-Miksaĵo de Foregene ankaŭ enhavas ROX-farbon, kiu estas oportuna por uzo en diversaj modeloj.

Real Time PCR Kit-Taqman

Malforta hidrogenliga traktado: La traktado de malfortaj hidrogenaj ligoj estas relative teknika afero.Nenio legis la manlibrojn de multaj ilaroj, sed neniu el ili menciis ĉi tiun temon.Fakte, ĝi estas tiel grava.La kombinaĵo de bazoj plejparte dependas de la forto de hidrogenaj ligoj.Fortaj hidrogenaj ligoj estas normala plifortigo, kaj malfortaj hidrogenaj ligoj kondukas al nespecifa plifortigo.Se malfortaj hidrogenaj ligoj ne povas esti eliminitaj bone, nespecifa plifortigo ne povas esti evitita.En la medio de la aŭtoro, nur kelkaj kompanioj rimarkis ĉi tiun problemon.Kiam vi aĉetas la ilaron, vi povas raporti al ĉu vi pripensis solvon ĉi-rilate por la ilaro, kiun vi volas elekti.

Volumo de reago: La 20-50ul-sistemo estas pli ofte uzata, kaj pli malgrandaj volumoj verŝajne kaŭzos erarojn.Ĝenerale, la kit-instrukcioj rekomendos la uzon de PCR-reagaj volumoj.Ne estu inteligenta kaj uzu pli malgrandajn volumojn por ŝpari kostojn.la celo de.La volumo rekomendita de la komercistoj efektive estis provita, kaj povas esti, ke ili ne povas solvi la problemon de eraroj kaŭzitaj de malgrandaj volumoj.
2. La fabrikanto kaj artikolnumero de la tubplato
Ĉiuj konas la principon de fluoreska kvanta PCR.Fluoreska kolekto estas ĉefe farita per PCR-tubaj ĉapoj.Elektante PCR-konsumeblajn konsumaĵojn, atentu du punktojn: bona lumtransdono kaj taŭga por la instrumento.Ĝenerale, la tabuloj kaj tuboj de ĉefaj markoj estas bone, sed vi devas zorge elekti laŭ adapto, alie vi ne povos uzi la instrumenton.

4. Pintnivela scio

MIQE (8) - validumado de qPCR
Ĉi tio estas la ĉefa prioritato de qPCR!Tiom da herooj falis en la sablon ĉi tie.Kompreneble, ankaŭ eblas, ke vi estas bonŝanca kaj la genoj, kiujn vi studis, estas simplaj, do vi flosis tra la glacikaverno laŭ la vento.La konfirminformoj de qPCR celas testi la fidindecon de la datenoj.Ni listigas la necesajn kontrolajn informojn jene:

1.Specifeca provo
La specifeco de celgena plifortigo estas testita per kontrolado ĉu la elektroforezbildo estas ununura grupo;sekvenca konfirmo;fandanta kurbo por vidi ĉu la pintmapo estas ununura;enzima digesta konfirmo kaj aliaj metodoj.
Ĉi tie, ni koncentriĝas pri tli analizo de nespecifa plifortigo uzante la metodon de fandado de kurboj.Ĝenerale, kiam ni desegnas enkondukojn, la grandeco de la produkta fragmento devas esti en la gamo de 80-200bp, kio faras la fandan temperaturon de la PCR-produkto 80-85 °C.Tial, se ekzistas diversaj pintoj, devas ekzisti aliaj nespecifaj plifortigaj produktoj;se la pinto aperas sub 80 °C, ĝi estas ĝenerale konsiderata kiel amordimero;se la pinto aperas super 85 °C, ĝi estas ĝenerale konsiderita kiel DNA-poluado aŭ pli Nespecifa plifortigo de grandaj fragmentoj.
Noto: Kelkfoje estas nur unu pinto je 80 °C.Nuntempe, ĉi tiu koncepto devas esti aligita.Estas verŝajne ke la plifortigrezultoj estas ĉiuj amordimeroj.

Normala fanda kurbo (ununura pinto kun neniu nespecifa plifortigo)

Problema degela kurbo (nespecifa plifortigo de falsaj pintoj)
【Analizo de kazo】

Estas ĉefa pinto, sed la amordimero estas serioza
La unu-pinta degela kurbo en la suba figuro povas facile trompi viajn okulojn, pensante, ke ĝi estas perfekta eksperimento, sed la rezulto estas tute malĝusta.Nuntempe, ni devas rigardi la degelan temperaturon.La pinta temperaturo estas sub 80 °C, kio estas tute primer-dimero.

Neniu celfragmento, ĉiuj amordimeroj
Ĉi tie, mia frato ne povas ĉesi.La suba bildo estas foto farita per poŝtelefono sendita al mi de fripono.La reakciiloj kiujn li uzis estas ĉiuj ofte uzataj markoj en la industrio.Li ŝanĝiĝis de unu T-prefiksa marko al alia T-prefiksa marko.Mi pensas, ke vi jam divenis.La fripono kriis al mi: “La reakciilo uzata en la unua bildo estas tro bona, kaj la pinto estas ununura.Poste, post uzi la reakciilon, kiun vi rekomendis, ĝi fariĝas kiel la dua bildo, kun miksitaj pintoj.Vi mizerigis min.“
Apartigu la du grafikaĵojn.Unuavide, unu havas ununuran pinton, kaj la alia havas duoblan pinton.Sensencaĵo, ununura pinto kompreneble estas bona.Ĉu tio estas vera?
Pli malbone ol Dou E, se mi metos la du bildojn en la suban bildon, vi tuj komprenos.Fakte, ni estas facile paralizitaj de ĉi tia bildo.Post zorgema analizo, ni trovis ke: la pinto de la unua figuro estas je 75 °C, kiu estas tute primer-dimero;la pinto de la dua figuro aperas je 75°C kaj 82°C, almenaŭ estas La produkto aperas.

Bildoj de sugestoj de studentoj
Do la fundamenta problemo ne estas la problemo de reakciiloj, sed la problemo de enkonduka dezajno.Samtempe ĝi ankaŭ pruvas, ke kelkaj grandaj markoj ne estas ferkvalitaj, kaj ĝi ankaŭ pruvas tion, kion diris mia frato antaŭe: Ne la reakciiga marko subtenas vian artikolon.Estas via artikolo kiu apogis la markon de reakciiloj.Nur imagu, se la fuŝulo ne ŝanĝus la reakcilojn, la malĝustaj datumoj estus senditaj al la ĵurnalo, kaj kio okazus estus tragedio.
2. Ct valoro de malplena kontrolo
Ne klarigu, se la malplena kontrolo havas Ct-valoron, ĉu ne estas poluado?Tamen, vi ankoraŭ bezonas kompreni, kiu malplena kontrolo havas Ct-valoron.Se ĝi estas NTC, tio signifas, ke ekzistas fremda DNA kiel reakciila poluado.Se ĝi estas NRT, tio signifas, ke la ĉerpita RNA havas DNA-poluadon.
3. Norma kurbo
Inkluzive de la deklivo kaj kalkulformulo, la PCR-efikeco povas esti kalkulita per la formulo.Perfekta eksperimento postulas, ke la deklivo de la norma kurbo alproksimiĝu al 3.32, kaj R² alproksimiĝu al 0.9999.
4. Lineara dinamika gamo
La dinamika intervalo de la reago estas lineara.Laŭ la ŝablono uzata por generi la norman kurbon, la dinamika gamo devus inkluzivi almenaŭ 5 koncentriĝajn gradientojn, kaj atenti la ŝanĝon de Ct-valoroj ĉe altaj koncentriĝaj gradientoj kaj malaltaj koncentriĝaj gradientoj.
5. Detekta precizeco
Ŝanĝoj en qPCR-rezultoj, tio estas malbona ripeteblo, tio estas, malbona precizeco, estas kaŭzitaj de multaj faktoroj, inkluzive de temperaturo, koncentriĝo kaj operacio.qPCR-precizeco ĝenerale iĝas malpli kontrolebla kiam kopinombro malpliiĝas.Ideale ene-eksperimenta vario, tiu teknika vario devus esti aparta de biologia vario, kaj biologiaj kopioj povas rekte trakti statistikajn diferencojn en qPCR-rezultoj inter grupoj aŭ terapioj.Aparte por diagnozaj analizoj, la plej bona inter-analiza precizeco (ripetebleco) trans ejoj kaj funkciigistoj devas esti raportita.
6. Detekta efikeco kaj LOD (en multiplex qPCR)
LOD estas la plej malalta koncentriĝo de 95% de pozitivaj provaĵoj detektitaj.Alivorte, la koncentriĝo de LOD enhavita ene de aro de celgenaj reproduktaĵoj ne devus superi 5% de la malsukcesaj reagoj.Dum farado de multoblaj qPCR-analizo, precipe por samtempa detekto de punktaj mutacioj aŭ polimorfismoj, multipleksa qPCR devas disponigi indicon ke la precizeco de multoblaj celfragmentoj ne estas endanĝerigita en la sama tubo, multobla detekto kaj ununura tubdetekto Efikeco kaj LOD devus esti la samaj.Precipe kiam altkoncentriĝintaj celgenoj kaj malaltkoncentriĝintaj celgenoj estas samtempe plifortigitaj, ĉi tiu problemo devas esti atentita.
Problemoj kaj solvojĜenerale, la problemoj ofte renkontitaj en qPCR-sencimigado temigas la sekvajn aspektojn:
·nespecifa plifortigo
·Malfacila elekto de primer-koncentriĝo kaj problemo kun primer-dimeroj
·La kalcia temperaturo estas malpreciza
·Sekundara strukturo influas plifortigan efikecon
nespecifa plifortigo
nespecifa plifortigookazas, oni ĝenerale konsideras, ĉu la enkonduka dezajno ne taŭgas, sed se vi ne rapidas ŝanĝi la enkondukojn, vi povas unue provi la jenajn metodojn (la principo ankaŭ estas alfiksita):
·Pliigi la tempan temperaturon - provu fari malfortajn hidrogenajn ligojn nekapablaj konservi;
·Mallongigi la tempon de annealing kaj plilongigo - redukti la ŝancon de malfortaj hidrogenaj ligoj;
· Redukti primerkoncentriĝon - reduktu la eblecon de ligado de redundaj enkondukoj kaj ne-celaj regionoj;
Malalta plifortiga efikeco
La kontraŭa situacio al nespecifa plifortigo - malalta plifortiga efikeco, kaj la mezuroj por trakti malaltan plifortigan efikecon estas ĝuste la malo:
·Plongigi la tempan recocidon kaj plilongigon;
·Ŝanĝu al tri-paŝa PCR kaj reduktu la tempan temperaturon;
·Pliigi la primeran koncentriĝon;
Ps: Multaj diplomiĝaj studentoj naskitaj en la 90-aj jaroj ne volas studi kiel sencimigi eksperimentojn, kaj esperas, ke la ilaro povas tute solvi la problemon (se vi volas iri al kompanio de reakciiloj por fari esploradon kaj disvolviĝon post diplomiĝo), fakte, la fabrikantoj de reakciiloj ankaŭ pensas tiel, mi esperas, ke ĝi estas stulta. Ĝi povas esti uzata kiam vi ricevas ĝin, do fabrikantoj de reakciiloj eluzis la multon da problemo de nespecifa penado por solvi la multan problemon de nespecifa plifortigo. ligaj sorbaj faktoroj.Por facile solvi la problemon, malsaĝuloj ankoraŭ devas legi la enkondukon de la reakcia kompanio por vidi ĉu ekzistas faktoro, kiu sorbas malfortajn hidrogenajn ligojn.
Malfacila elekto de primerkoncentriĝo kaj problemo kun primer-dimeroj
Metodo 1: Ĝenerale, la kit-instrukcioj por qPCR rekomendis sistemojn kaj rekomenditajn primerkoncentriĝojn.
Metodo 2: Sencimigado per agordo de la komenca koncentriĝgradiento.La suba bildo estas ŝtelita de firmao por ilustri.La malsupra figuro montras la fluoreskecajn kvantajn rezultojn faritajn kun tri komencaj koncentriĝgradientoj (100nM, 250nM, 500nM) kaj kvar ŝablonaj koncentriĝgradientoj (0.1ng, 1ng, 10ng, 100ng).La Ct-valoro de la eksperimentaj rezultoj estas punktskribita jene:

Selektado de Enkonduka Koncentriĝo Kunligiĝu ĉiun enkondukan koncentriĝon en linion jene:

La elekto de primerkoncentriĝo estas evidenta, la lineara rilato de la primerkoncentriĝo de 100nM kaj 250nM estas pli bona, kaj la lineara rilato de la primerkoncentriĝo de 500nM estas relative malbona.En 100nM kaj 250nM, la Ct-valoro de 250nM estas relative malgranda, do la optimuma primerkoncentriĝo estas 250nM.Ĝenerale severaj primer-dimeroj povas esti viditaj en la degela kurbo.Kio se la dezajnitaj enkondukoj ne povas eviti primer-dimerojn?
Metodo 3: Reduktu la kvanton da enkondukoj kaj pliigu la kalsonan temperaturon (ne necesas klarigi).
La empiria valoro de la kalcia temperaturo estas 60 °C.Se vi ne certas, kiel elekti pli taŭgan kalsonan temperaturon?La respondo estas la sama kiel la elekto de unua koncentriĝo -gradienta testo.Prenu foton de Bio-rad-kompanio por ilustri la problemon.Por la plifortigo de certa celfragmento, starigu ok temperaturgradientojn, ĉiu kun tri ripetoj, kaj la akirita plifortiga kurbo estas kiel sekvas:

Elekto de Temperaturo de Kalkulado:
·70°C, 69°C—Esence, la enkondukoj ne povas esti kombinitaj, do ne estas plifortigo.
·67.3°C - Estas malgranda kvanto de plifortigo ĉe la komenco, kaj la Ct-valoro estas relative granda.
·64,5°C——La Ct-valoro malpliiĝas.
·Je 60,7 °C, 58,0 °C, 56,2 °C, kaj 55,0 °C, la Ct-valoroj baze tendencis esti stabilaj, sed la finaj fluoreskecaj valoroj estis malsamaj.
Kiel elekti?Principo: La unua principo estas la pli alta Ct-valoro.Por la sama Ct-valoro, elektu pli altan kalsonan temperaturon por eviti dimerigon kaj nespecifan plifortigon.Kvankam ekzistas pli alta fluoreskecvaloro je 55 °C, povas ekzisti dimeroj aŭ nespecifa plifortigo en ĝi.
Sed se vi estas same inteligenta kiel vi, vi certe pensos: Logike parolante, se la PCR-reago estas tre specifa, kondiĉe ke la primerkoncentriĝo superas la minimuman postulon, la altaj kaj malaltaj punktoj ne havu efikon, same kiel fluoreskaj tinkturoj kaj dNTP-oj.Efektive, tiel longe kiel la kalcia temperaturo estas optimumigita konvene, la efiko de primerkoncentriĝo sur Ct-valoro nature estos minimumigita.

La kalcia temperaturo estas optimumigita konvene, kaj la efiko de primerkoncentriĝo sur CT estos minimumigita
Sekundara strukturo influas plifortigan efikecon
Ni prenu la bildon el Bio-rad por ilustri la problemon.Ĝi ankaŭ dizajnas temperaturgradienton por plifortigi genon kun sekundara strukturo.

Malĉefa strukturo aperas
Oni povas vidi, ke kiam la temperaturgradiento malpliiĝas, produktoj komencas aperi kaj la Ct-valoro antaŭeniras, atingante la minimuman valoron je 60.7°C, kaj tiam kiam la temperaturgradiento malpliiĝas, la Ct-valoro iĝas pli granda.Male, kiam la temperaturo pliiĝas, la sekundara strukturo malfermiĝas kaj la plifortiga efikeco pliiĝas.Post atingi certan temperaturon, plialtigi la temperaturon ne povas plibonigi la plifortigan efikecon.Ĉar la enkondukoj ne povas esti stabile kombinitaj ĉi-momente.Tial,serĉu la temperaturon kun la plej malalta Ct-valoro, kiu estas la plej bona temperaturo por plifortigi la sekundaran strukturon ŝablonon!Kompreneble, inteligentaj malsaĝuloj devas scii, ke se ĝi ne estas necesa, plej bone estas ŝanĝi la enkondukojn kaj eviti la malĉefajn strukturregionon.
5. Aplika nivelo
MIQE - Analizo de datumoj

La datuma analizo estas plejparte donita de la fluoreska kvanta PCR-instrumento.En la antaŭa artikolo, multe da datuma analizo laboro estis farita, kiel la malplena kontrolo, kiu estis klarigita en la dezajno de la eksperimento.La internaj referencaj genoj, ripetaj nombroj ktp. estis klarigitaj., ĉi tie ni ĉefe klarigas la aplikon de qPCR.
qPCR estas vaste uzita, kaj eksperimenta konfirmo kaj nukleaacida diagnozo estas la plej ofte uzitaj scenaroj.
absoluta kvantigo
Log (komenca koncentriĝo) havas linearan rilaton kun la nombro da cikloj.Norma kurbo povas esti desegnita de normo kun konata komenca kopinombro, tio estas, la linia rilato de la plifortiga reago povas esti akirita.Laŭ la Ct-valoro de la specimeno, la koncentriĝo en la specimeno povas esti kalkulita.La kvanto de ŝablonoj por inkluzivi.

Absoluta Kvanta Kalkula Metodo
Absoluta kvantigo devas esti bazita sur la norma kurbo.Por fari norman kurbon, normo estas postulata.Kutime, la normo estas plasmido akirita klonante la celgenon.Kial ĝi estas plasmido?Ĉar cirkla plasmida DNA estas la plej stabila.Diluu la norman produkton en 5 ĝis 6 gradientoj laŭ la duobliga proporcio (10-obla diluo), kaj atentu la unuformecon dum diluado.Lasu la Ct-valoron fali inter 15-30.

Norma preparo
Samtempe, la specimeno testita ankaŭ devus esti diluita laŭe (memoru la diluan faktoron), kaj la Ct-valoro ankaŭ devus fali inter 15-30.La norma produkto + la specimeno testenda estas kunmetitaj sur la maŝinon.Post la kuro, norma kurbo estis farita kun la norma substanco, kaj la provaĵoj estis alportitaj en la norman kurbon por kalkuli la koncentriĝon.
Hepatito B-virusa HBV-kvantigo estas tipa absoluta kvantigo, kiu povas kalkuli la virusan kopinombron en 1ml da sango.
Kalkulo de kopinumero
Specimena koncentriĝo por esti testita (ng/ul) = OD260 × 50ug/ml × dilua faktoro
Specimena molekula pezo = nombro da bazoj × 324
La kopinumero de la provaĵo (kopioj/ul) = la koncentriĝo de la provaĵo / la molekula pezo de la specimeno × 6 × 1014

Kalkula metodo de kopinumero

Ĉi-supra estas la kalkulmetodo por determini la kvanton.Ĉi tio estas matematika problemo, kiu povas esti solvita post diplomiĝo de mezlernejo, kaj matematikaj problemoj estas ĝenerale solvitaj per komputiloj.Se vi ne komprenas, vi povas veni por komuniki.
relativa kvantigo
Relativa kvantigo estas ĉefe uzata en scienca esplorado.Kiom da virusoj estas en 1ml da sango, kaj ĝi estas DNA-viruso, tio estas relative determinisma evento: la kvanto da sango povas esti determinita, kaj la DNA-viruso estas relative stabila.Tamen, estas malfacile por ni kompari la nombron da transskribaj kopioj de certa geno en folio, ĉar estas malfacile determini la grandecon, pezon kaj tenerecon de la folio, la kvanto de ĉerpita RNA estas malfacile determini, kaj la efikeco de inversa transskribo ankaŭ malfacilas determini, tio estas, ajna paŝo povas igi la eksperimentajn datumojn havi cimojn kaj ne povas esti uzataj.
Tial, relativa kvantigo devas enkonduki elementon:la interna referenca geno.
Alivorte, relativa kvantigo estas fakte komparo inter la celgeno kaj la interna referenca geno.Kompare en la sama histo kaj la sama ĉelo, la influo de specimena grandeco, RNA-eltira kvanto, inversa transskriba efikeco kaj PCR-efikeco estas relative malgranda.Pro la malgranda specimena grandeco, kaj internaj referencaj genoj kaj celgenoj estis relative reduktitaj.Jen kial ni antaŭe emfazis unuformecon kaj stabilecon.
Internaj referencaj genoj estas ĝeneralemastrumaj genoj( mastrumaj genoj), kiuj rilatas al klaso de genoj kiuj estas stabile esprimitaj en ĉiuj ĉeloj, kaj iliaj produktoj estas necesaj por konservi la bazajn vivaktivecojn de ĉeloj.
Ne konfuzu ĉi tiun koncepton.Mastrumaj genoj estas biologiaj funkcioperiodoj, dum internaj referencgenoj estas eksperimentaj teknikaj esprimoj.Mastrumaj genoj devas pasigi validumon antaŭ ol ili povas esti elektitaj kiel internaj referencgenoj.
Ekzemple, ni elektis plurajn mastrumajn genojn en la suba figuro por testi iliajn esprimnivelojn en malsamaj histoĉeloj, kaj trovis, ke la esprimniveloj de β-2-mikroglobulino estis sufiĉe malsamaj ol tiuj de la aliaj tri genoj, do ili ne povus esti uzataj kiel internaj referencaj genoj.

Post komprenado de la korekta funkcio de la interna referenca geno, du algoritmoj estas derivitaj pro la enkonduko de la interna referenca geno.
·duobla norma kurba metodo
·2 – △△Ct-metodo (CT-valora kompara metodo)
Se vi interesiĝas pri studi specojn kaj genajn funkciojn, bonvolu rezigni pri la esplorado pri algoritmoj kaj uzi formulojn rekte, aŭ uzi maŝinojn rekte;se vi estas honesta ulo pri matematiko kaj inĝenierado, bonvolu senti vin libera.
metodo de duobla norma kurba
Kvantu la celgenon kaj mastruman genon de la kontrolprova specimeno kaj la provaĵo testenda per la norma kurbo, kaj poste kalkulu la relativan valoron laŭ la kalkulformulo, kiu estas la relativa esprimnivelo.
Avantaĝoj: simpla analizo, relative simpla eksperimenta optimumigo
Malavantaĝo: Por ĉiu geno, ĉiu rondo de eksperimentoj devas fari norman kurbon
Apliko: Unu el la du plej ofte uzitaj kaj agnoskitaj relativaj kvantaj metodoj en la studo de genesprimo-reguligo
La formulo estas kiel sekvas:

Ekzemploj estas kiel sekvas:

Kalkulu la relativan kvanton surbaze de la kvanta rezulto
2 - △△Ct-metodo (CT-valora kompara metodo)

Avantaĝoj: Ne necesas fari norman kurbon
Malavantaĝoj: Oni supozas, ke la plifortiga efikeco estas proksima al 100%;la norma devio estas < 5%, kaj la norma kurbo kaj la efikeco inter ĉiu plifortigo estas supozitaj esti konsekvencaj;la optimumigo de eksperimentaj kondiĉoj estas pli komplika.
Apliko: Unu el la du plej ofte uzitaj kaj agnoskitaj relativaj kvantaj metodoj en la studo de genesprimo-reguligo

Kompreneble, la plifortiga efikeco estas kutime neeble esti perfekte 1. Korekta metodo: Se ni scias, ke la celgeno kaj la referenca geno havas la saman plifortigan efikecon, sed la plifortiga efikeco ne estas egala al 1, tiam 2－△△Ct povas esti korektita kiel: (1+E )－△△△, tiam la plifortiga efikeco povas esti korektita, se la plifortiga efikeco, ekzemple, povas esti korektita, 95 al Ct. 1.95－△△Ct
Ĝis nun, la enhavo pri fluoreska kvanta PCR finiĝis.