Estas konate, ke en la centra dogmo, RNA estas la transskriba mediaciisto inter DNA kaj proteinesprimo.Kompare kun la detekto de DNA, la detekto de RNA povas pli objektive reflekti la genekspresion en organismoj.Eksperimentoj implikantaj RNA inkludas: qRT-PCR, RNA-Seq, kaj fuziogena detekto, ktp. Surbaze de la karakterizaĵoj de RNA mem (la sukerringo de RNA havas unu pli liberan hidroksilgrupon ol la sukerringo de DNA), kunligita kun granda nombro da RNasoj en la medio, RNA estas pli malstabila kaj pli facile esti degradita ol DNA.Rubo en, rubo ekstere, se la kvalito de RNA ne estas bona, tiam la eksperimentaj rezultoj devas esti nekontentigaj, specife manifestitaj kiel malprecizaj datumoj aŭ malbona ripeteblo.Tial, pli da atento devas esti pagita al la prilaborado de RNA, kaj la ligo de kvalito-kontrolo ankaŭ estas pli grava por certigi la precizecon kaj precizecon de postaj eksperimentaj datumoj.
Por la kvalitkontrolo de RNA, ekzistas ĝenerale la sekvaj ofte uzitaj metodoj:
- Spektrofotometrio
- elektroforezo de agaroza ĝelo
- Agilent Bioanalizilo
- realtempa fluoreska kvanta PCR
- Qubit-fluoreska tinkturfarba metodo
01 Spektrofotometrio
RNA havas konjugaciitajn duoblajn ligojn kaj havas absorban pinton ĉe ondolongo de 260nm.Laŭ la leĝo de Lambert-Beer, ni povas kalkuli la RNA-koncentriĝon de la absorbadpinto ĉe 260nm.Krome, ni ankaŭ povas kalkuli la purecon de RNA laŭ la rilatumo de 260nm, 280nm kaj 230nm absorbaj pintoj.280nm kaj 230nm estas la sorbaj pintoj de proteinoj kaj malgrandaj molekuloj, respektive.La proporcio de A260/A280 kaj A260/A230 de kvalifikita RNA-pureco devus esti pli granda ol 2. Se ĝi estas malpli ol 2, tio signifas, ke ekzistas proteino aŭ malgranda molekula poluado en la RNA-provaĵo kaj devas esti purigita denove.Poluadfontoj influos kontraŭfluajn eksperimentojn, kiel ekzemple malhelpado de la plifortiga efikeco de PCR-reagoj, rezultigante malprecizajn kvantajn rezultojn.La pureco de RNA havas grandan influon sur postaj rezultoj, do spektrofotometrio estas ĝenerale nemalhavebla kvalitkontrola ligo en la unua paŝo en nukleaacidaj eksperimentoj.
Figuro 1. Tipa RNA/DNA-Sorba Spektro
02 Elektroforezo de agarose-ĝelo
Aldone al pureco, la integreco de RNA ankaŭ estas unu el la gravaj indikiloj por juĝi la kvaliton de RNA.La degenero de RNA kondukos al granda nombro da mallongaj fragmentoj en la provaĵo, do la nombro da RNA-fragmentoj kiuj povas esti efike detektitaj kaj kovritaj per la referenca sekvenco estos reduktita.RNA-integreco povas esti kontrolita per elektroforezo de totala RNA sur 1% agaroseĝelo.Ĉi tiu metodo povas mem agordi la ĝelon aŭ uzi la antaŭfabrikitan E-Gel™-Sistemon por integreco-testado.Pli ol 80% de totala RNA estas ribosomal RNA, la plimulto de kiu estas kunmetita de 28S kaj 18S rRNA (en mamulaj sistemoj).Bonkvalita RNA montros du evidentajn brilajn stangojn, kiuj estas 28S kaj 18S brilajn stangojn, respektive, je 5 Kb kaj 2 Kb, kaj la proporcio tendencos esti proksima al 2:1.Se ĝi estas en difuza stato, tio signifas ke la RNA-provaĵo eble estis degradita, kaj estas rekomendite uzi la metodon priskribitan poste por plu testi la kvaliton de RNA.
Figuro 2. Komparo de degradita (leno 2) kaj nerompita RNA (leno 3) sur agaroza ĝela elektroforezo
03 Agilent Bioanalizilo
Krom la metodo de elektroforezo de agarosa ĝelo priskribita supre, kiu povas helpi nin identigi la integrecon de RNA simple kaj rapide, ni ankaŭ povas uzi la bioanalizilon Agilent por determini la integrecon de RNA.Ĝi uzas kombinaĵon de mikrofluidiko, kapilara elektroforezo kaj fluoreskeco por taksi RNA-koncentriĝon kaj integrecon.Uzante la enkonstruitan algoritmon por analizi la profilon de la RNA-provaĵo, la Agilent-bioanalizilo povas kalkuli referencan RNA-integrecvaloron, RNA-Integreca Nombro (ĉi-poste nomata RIN) [1].Ju pli granda la valoro de RIN, des pli alta la integreco de la RNA (1 estas ekstreme degradita, 10 estas la plej kompleta).Kelkaj eksperimentoj implikantaj RNA sugestas uzi RIN kiel parametron por kvalita takso.Prenante alt-produktajn sekvencadajn eksperimentojn (ĉi-poste nomatajn NGS) kiel ekzemplon, la gvidlinioj de Oncomine™ Homa Imuna Repertuaro, kiu estas uzata por detekti B-ĉelojn kaj T-ĉelajn antigenajn ricevilojn en la Oncomine-panela serio de Thermo Fisher, sugestas, ke specimenoj kun RIN-valoroj pli grandaj ol 4, Pli efikaj legaĵoj kaj klonoj povas esti mezuritaj (3).Estas malsamaj rekomenditaj intervaloj por malsamaj paneloj, kaj ofte pli alta RIN povas alporti pli efikajn datumojn.
Figuro 3, en eksperimentoj de Oncomine™ Human Imune Repertoire, specimenoj kun RIN pli granda ol 4 povas detekti pli efikajn legadojn kaj T-ĉelklonojn.【2】
Tamen, la RIN-valoro ankaŭ havas kelkajn limigojn.Kvankam RIN havas altan korelacion kun la kvalito de NGS-eksperimentaj datenoj, ĝi ne taŭgas por FFPE-provaĵoj.FFPE-provaĵoj estis kemie traktitaj dum longa tempo, kaj la eltirita RNA ĝenerale havas relative malaltan RIN-valoron.Tamen, ĉi tio ne signifas, ke la efikaj datumoj de la eksperimento devas esti nekontentigaj.Por precize taksi la kvaliton de FFPE-provaĵoj, ni devas uzi mezurojn krom RIN.Aldone al RIN, Agilent-bioanalizilo ankaŭ povas kalkuli DV200-valoron kiel taksadparametron de RNA-kvalito.DV200 estas parametro kiu kalkulas la proporcion de fragmentoj pli grandaj ol 200 bp en RNA-provaĵo.DV200 estas pli bona indikilo de FFPE specimena kvalito ol RIN.Por la RNA ĉerpita de FFPE, ĝi havas tre altan korelacion kun la nombro da genoj kiuj povas esti efike detektitaj kaj la diverseco de genoj [3].Kvankam DV200 povas kompensi la mankojn en la kvalita detekto de FFPE, la bioanalizilo Agilent ankoraŭ ne povas amplekse analizi la kvalitajn problemojn en RNA-provaĵoj, inkluzive ĉu ekzistas inhibitoroj en la specimenoj.Inhibitoroj mem povas influi la plifortigan efikecon de kontraŭfluaj eksperimentoj kaj redukti la kvanton de utilaj datenoj.Por scii ĉu estas inhibilo en la specimeno, ni povas adopti la realtempan fluoreskan kvantan PCR-metodon priskribitan poste.
04 realtempa fluoreska kvanta PCR
La realtempa fluoreska kvanta PCR-metodo povas ne nur detekti la inhibilojn en la specimeno, sed ankaŭ precize reflekti la kvaliton de RNA en la FFPE-specimeno.Kompare kun Agilent-biologiaj analiziloj, realtempaj fluoreskecaj kvantaj instrumentoj estas pli popularaj en gravaj biologiaj laboratorioj pro sia pli larĝa apliko.Por testi la kvaliton de RNA-specimenoj, ni nur bezonas aĉeti aŭ prepari primerajn sondojn por internaj referencaj genoj, kiel GUSB (Kato n-ro Hs00939627).Uzante ĉi tiun aron de enkondukoj, enketoj kaj normoj (totala RNA de konata koncentriĝo) por fari absolutajn kvantajn eksperimentojn, la efika RNA-fragmentokoncentriĝo povas esti kalkulita kiel la taksadnormo de RNA-kvalito (Funkcia RNA-Kvanto (FRQ) mallonge).En NGS-testo, ni trovis, ke la FRQ de RNA-provaĵoj havas tre altan korelacion kun la efika datumvolumo.Por ĉiuj specimenoj pli grandaj ol 0.2ng/uL FRQ, almenaŭ 70% de la legaĵoj povas efike kovri la referencsekvencon (Figuro 4).
Figuro 4, la FRQ-valoro detektita per la fluoreskeca kvanta metodo havas tre altan korelacion (R2>0.9) kun la efikaj datumoj akiritaj en la NGS-eksperimento.La ruĝa linio estas la FRQ-valoro egala al 0,2 ng/uL (log10 = -0,7).【4】
Krom esti aplikebla al FFPE-provaĵoj, la realtempa kvanta PCR-metodo ankaŭ povas efike monitori inhibitorojn en provaĵoj.Ni povas aldoni la specimenon por esti detektita en la reagsistemon kun Interna Pozitiva Kontrolo (IPC) kaj ĝia Testo, kaj tiam fari fluoreskecan kvantigon por akiri la Ct-valoron.Se la Ct-valoro postrestas malantaŭ la Ct-valoro en la sen-prova reago, ĝi indikas ke la inhibitoro ĉeestas en la provaĵo kaj malhelpas la plifortigan efikecon en la reago.
05 Qubit fluoreska tinkturfarba metodo
Qubit Fluorometro estas la plej ofte uzata malgranda aparato por nuklea acido koncentriĝo kaj pureco detekto, kiu estas facile funkcii kaj ekzistas en preskaŭ ĉiu molekula biologia laboratorio.Ĝi precize kalkulas la koncentriĝon de nuklea acido per detektado kaj fluoreska tinkturo de ligado de nuklea acido (Qubit-detekta reakciilo).Qubit havas altan sentemon kaj specifecon, kaj povas precize kvantigi RNA ĝis pg/µL koncentriĝo.Krom la konata kapablo precize kvantigi nuklean acidan koncentriĝon, la plej nova nova modelo de Thermo Fisher, Qubit 4.0, ankaŭ povas detekti la integrecon de RNA.La RNA-detektosistemo de Qubit 4.0 (RNA IQ Assay) detektas la integrecon de RNA samtempe detektante du specifajn fluoreskajn tinkturfarbojn.Tiuj du fluoreskaj tinkturfarboj povas ligi al grandaj fragmentoj kaj malgrandaj fragmentoj de RNA, respektive.Tiuj du fluoreskaj tinkturfarboj indikas la proporcion de grandaj fragmentoj de RNA en la provaĵo, kaj de tio la IQ (Integreco kaj Kvalito) valoro reprezentanta la RNA-kvaliton povas esti kalkulita.La IQ-valoro estas aplikebla al kaj FFPE kaj ne-FFPE-provaĵoj, kaj havas grandan influon sur la posta sinsekva kvalito.Prenante NGS-eksperimentojn kiel ekzemplon, en la RNA-Seq-testeksperimentoj faritaj sur la platformo Ion torrent™, plej multaj specimenoj kun IQ-valoroj pli grandaj ol 4 havis almenaŭ 50% efikajn legadojn (Figuro 5).Kompare kun la supre menciitaj detektaj metodoj, Qubit IQ Assay estas ne nur pli oportuna por funkcii kaj prenas malpli da tempo (ene de kvin minutoj), sed ankaŭ havas grandan korelacion inter la mezurita parametro IQ-valoro kaj la datuma kvalito de laŭfluaj eksperimentoj.
Figuro 5, ekzistas granda korelacio inter la Qubit RNA IQ-valoro kaj la mapitaj legadoj de RNA-Seq.【5】
Per la ĉi-supra enkonduko, mi kredas, ke ĉiuj havas sufiĉan komprenon pri malsamaj RNA-kvalitkontrolmetodoj.En la praktiko, vi povas elekti
la responda metodo laŭ la specimena tipo kaj ekzistantaj instrumentoj.Nur bone kontrolante la kvaliton de RNA ni povas eviti la fiaskon de postaj eksperimentoj kaŭzitaj de malbona specimena kvalito, tiel ŝparante altvaloran tempon, energion kaj koston.
Referencaj produktoj:
referencoj
【1】Schroeder, A., Mueller, O., Stocker, S. et al.La RIN: RNA-integrecnombro por asignado de integrecvaloroj al RNA-mezuradoj.BMC Molecular Biol 7, 3 (2006).https:// doi .org/10.1186/1471-21 99-7-3
【2】Oncomine Human Imune Repertoire User Guide (Eldonejo n-ro MAN0017438 Rev. C.0).
【3】Leah C Wehmas, Charles E Wood, Brian N Chorley, Carole L Yauk, Gail M Nelson, Susan D Hester, Enhanced Quality Metrics for Assessing RNA Derived From Archival Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissue Samples, Toxicological Sciences, Volume 170, August Issue, Paĝo 237192https://doi.org/10.1093/toxsci/
Afiŝtempo: Jun-12-2023
