Steriligo de pipetpintoj kaj EP-tuboj, ktp.

1. Preparu 0,1% (unu milono) DEPC (tre toksa substanco) kun dejonigita akvo, uzu ĝin zorge en fumkapuĉo, kaj konservu ĝin je 4 °C for de lumo;

DEPC-akvo estas pura akvo traktita per DEPC kaj steriligita per alta temperaturo kaj alta premo.Provita esti libera de RNase, DNase kaj proteinase.

2. Metu la pipetpinton kaj EP-tubon en 0.1% DEPC, kaj certigu, ke la pipetpinto kaj EP-tubo estas plenigitaj per 0.1% DEP.

3. Protektu kontraŭ lumo, lasu stari, dum la nokto (12-24h)

4. La skatolo enhavanta la pinton kaj EP-tubon ne bezonas esti trempita en DEPC.Post malglate forigi la DEPC-akvon en la pinto aŭ EP-tubo, paku ĝin kaj envolvu ĝin.

5. 121 celsiaj gradoj, 30min

6. 180 celsiusgradoj, seka dum pluraj horoj (almenaŭ 3 horoj)

Noto: a.Portu lateksajn gantojn kaj maskojn kiam vi manipulas DEPC!b, aŭ sen DEPC steriligo, 130 ℃, 90 min aŭtoklavo (multaj laboratorioj alta temperaturo steriligo dufoje)

Konsideroj pri eltiro de RNA

Du gravaj fenomenoj de hista RNA-izolaj fiasko

RNA-degenero kaj restaĵoj de malpuraĵoj en histoj,pri degradado, ni unue rigardu kial RNA ĉerpita el kulturitaj ĉeloj ne estas facile degradita.Ekzistantaj RNA-ekstraktaj reakciiloj ĉiuj enhavas komponentojn kiuj rapide malhelpas RNazon.Aldonu la lisaton al la kulturitaj ĉeloj, kaj simple miksu ĝin, ĉiuj ĉeloj povas esti ĝisfunde miksitaj kun la lisato, kaj la ĉeloj estas tute lizitaj.Post kiam la ĉeloj estas lizitaj, la aktivaj ingrediencoj en la lisato tuj malhelpas la intraĉelan RNazon, do la RNA restas sendifekta.Tio estas, ĉar la kulturitaj ĉeloj estas facile kaj plene kontaktitaj kun la lisato, ilia RNA ne estas facile degradita;aliflanke, la RNA en la histo estas facile degradita ĉar la ĉeloj en la histo ne facilas rapide kontakti la lizaton.pro sufiĉa kontakto.Do,supozante ke ekzistas maniero turni la histon en ununuran ĉelon dum malhelpado de RNA-agado, la problemo de degenero povus esti tute solvita.

Likva nitrogenmuelado estas la plej efika tia metodo.Tamen, la likva nitrogena muelada metodo estas tre ĝena, precipe kiam la nombro da specimenoj estas granda.Ĉi tio estigis la sekvan plej bonan aferon: la homogenigilo.Lahomogenigilometodo ne pripensas la demandon de kiel RNase-agado estas malhelpita antaŭ ol ĉeloj estas kontaktitaj kun la lisato, sed prefere preĝas ke la indico de histointerrompo estas pli rapida ol la rapideco ĉe kiu intraĉela RNase degradas RN.

La efiko de elektra homogenizilo estas pli bona,kaj la efiko de vitra homogenigilo estas malbona, sed ĝenerale, la homogeniga metodo ne povas malhelpi la degradan fenomenon.Tial, se la eltiro estas degradita, la originala elektra homogenizilo devas esti uzata por mueli kun likva nitrogeno;la originala vitra homogenizilo devas esti ŝanĝita al elektra homogenizilo aŭ rekte muelita kun likva nitrogeno.La problemo estas preskaŭ 100% realigebla.esti solvita.

La malpuraĵrestproblemo influanta postajn eksperimentojn havas pli diversajn kaŭzojn ol degenero, kaj la solvoj estas ekvivalente malsamaj.Konklude,se ekzistas degenero aŭ restaj malpuraĵoj en la histo, la eltira metodo/reakciilo por la specifa eksperimenta materialo devas esti optimumigita.Vi ne devas uzi viajn altvalorajn specimenojn por optimumigo: vi povas aĉeti kelkajn malgrandajn bestojn kiel fiŝojn/kokidojn de la merkato, preni la respondan parton de la materialo por RNA-eltiro, kaj la alian parton por protein-eltiro - mueli per buŝo, stomako kaj intesto Ekstrakto.

La cela RNA de la ĉerpita RNA estas uzata por malsamaj sekvaj eksperimentoj, kaj ĝiaj kvalitpostuloj estas malsamaj

cDNA-biblioteka konstruo postulas RNA-integrecon sen restaĵoj de enzimreagaj inhibitoroj;Norda postulas pli altan RNA-integrecon kaj pli malaltajn postulojn por restaĵoj de enzimreagaj inhibitoroj;RT-PCR ne postulas tro altan RNA-integrecon,sed malhelpas enzimajn reagojn.Postuloj pri restaĵoj estas striktaj.La enigo determinas la eliron;ĉiufoje kiam la celo estas akiri la plej altan purecan RNA, ĝi kostos la homojn kaj monon.

Kolekto/Stokado de Specimenoj

Faktoroj influantaj degradadon Post kiam la provaĵo forlasas la vivantan korpon/aŭ la originan kreskomedion, la endogenaj enzimoj en la provaĵo komencos degradi RNA,kaj la degeneroprocento rilatas al la enhavo de endogenaj enzimoj kaj temperaturo.Tradicie, ekzistas nur du manieroj por tute malhelpi endogenan enzimaktivecon: aldoni lisaton tuj kaj homogenigi ĝisfunde kaj rapide;tranĉu en malgrandajn pecojn kaj tuj frostigu en likva nitrogeno.Ambaŭ aliroj postulas rapidan operacion.Ĉi-lasta taŭgas por ĉiuj specimenoj, dum la unua taŭgas nur por histoj kun malalta enhavo de ĉeloj kaj endogenaj enzimoj kaj pli facile homogenigeblaj.Specife, planta histo, hepato, timuso, pankreato, lieno, cerbo, graso, muskola histo ktp. estas plej bone frostigitaj kun likva nitrogeno antaŭ ol daŭrigi.

Fragmentado kaj homogenigo de specimenoj

Faktoroj influantaj degradiĝon kaj rendimenton Specimenfragmentiĝo estaspor ĝisfunda homogenigo, kiu estas por kompleta kaj kompleta liberigo de RNA.Ĉeloj povas esti rekte homogenigitaj sen esti rompitaj.Histoj povas esti homogenigitaj nur post esti rompitaj.Gisto kaj bakterioj devas esti rompitaj kun respondaj enzimoj antaŭ ol ili povas esti homogenigitaj.Histoj kun pli malalta endogena enzimenhavo kaj pli facila homogenigo povas esti disbatitaj kaj homogenigitaj samtempe en la lisato per homogeniganto;planta histo, hepato, timuso, pankreato, lieno, cerbo, graso, muskola histo kaj aliaj specimenoj, Ili estas aŭ altaj en endogenaj enzimoj aŭ ne facile homogeniĝas,do histo-interrompo kaj homogenigo devas esti faritaj aparte.La plej fidinda kaj plej produktiva metodo de fragmentiĝo estas muelado kun likva nitrogeno, kaj la plej fidinda metodo de homogenigo estas la uzo de elektra homogenizilo.Speciala noto pri muelado kun likva nitrogeno: la specimeno ne devas esti degelita dum la tuta muelada procezo, ĉar endogenaj enzimoj pli verŝajne funkcias kiam frostitaj.

Elekto de lisato

Influante la oportunon de operacio kaj la faktoroj de restaj endogenaj malpuraĵoj La ofte uzataj lizaj solvoj preskaŭ povas malhelpi la agadon de RNase.Tial, la ŝlosila punkto de elektado de lizosolvo estas konsideri kombine kun la puriga metodo.Estas unu escepto:specimenoj kun alta enhavo de endogenaj enzimoj rekomendas uzi lisaton enhavantan fenolon por pliigi la kapablon malaktivigi endogenajn enzimojn.

Elekto de puriga metodo

Faktoroj, kiuj influas postrestantajn endogenajn malpuraĵojn, eltiran rapidon Por puraj specimenoj kiel ĉeloj, kontentigaj rezultoj povas esti akiritaj per preskaŭ ajna purigmetodo ĉemane.Sed por multaj aliaj specimenoj, precipe tiuj kun altaj niveloj de malpuraĵoj kiel plantoj, hepato, bakterioj, ktp., elekti taŭgan purigan metodon estas decida.La kolumna centrifuga purigmetodo havas rapidan eltiran rapidecon kaj povas efike forigi malpuraĵojn, kiuj influas la postan enzimecan reagon de RNA, sed ĝi estas multekosta (Foregene povas oferti kostefikajn ilarojn, alklaku pli da detaloj.ĉi tie);uzante ekonomiajn kaj klasikajn purigajn metodojn, kiel LiCl-pluvo, ankaŭ povas akiri kontentigajn rezultojn, sed la funkciada tempo estas longa..

"Tri Disciplinioj kaj Ok Atentoj" por RNA Eltiro

Disciplino 1:Ĉesigu la poluadon de eksogenaj enzimoj.

Noto 1:Strikte portu maskojn kaj gantojn.

Noto 2:La centrifugiltuboj, Konsilkapoj, pipetstangoj, elektroforezaj tankoj kaj eksperimentaj benkoj implikitaj en la eksperimento devas esti plene forigitaj.

Noto 3:La reakciiloj/solvoj implikitaj en la eksperimento, precipe akvo, devas esti RNase-liberaj.

Disciplino 2:Bloki la agadon de endogenaj enzimoj

Noto 4:Elektu taŭgan homogenigan metodon.

Noto 5:Elektu taŭgan lizaton.

Noto 6:Kontrolu la komencan kvanton de la specimeno.

Disciplino 3:Klarigu vian eltiran celon

Noto 7:Kun iu lisatsistemo proksimiĝanta al la maksimuma komenca kvanto de specimeno, la eltira sukcesprocento falas akre.

Noto 8:La nura ekonomia kriterio por sukcesa RNA-ekstraktado estas sukceso en postaj eksperimentoj, ne rendimento.

Supraj 10 Fontoj de RNase-Kontaminado

1. Fingroj estas la unua fonto de eksogenaj enzimoj, do gantoj devas esti portitaj kaj anstataŭigitaj ofte.Krome, maskoj ankaŭ devas esti portitaj, ĉar spirado ankaŭ estas grava fonto de enzimoj.Plia avantaĝo de portado de gantmasko estas protekti la eksperimentanton.

2. Pipetpintoj, centrifugiltuboj, pipetoj - RNase ne povas esti malaktivigita per steriligo sole, do pipetkonsiloj kaj centrifugiltuboj devus esti traktitaj per DEPC, eĉ se ili estas markitaj kiel DEPC traktitaj.Plej bone estas uzi special-celan pipeton, viŝu ĝin per 75% alkohola kotona bulo antaŭ uzo, precipe la bastono;krome, nepre ne uzu kapforigilon.

3. La akvo/bufro devas esti libera de RNase-poluado.

4. Almenaŭ la testa tablo devas esti purigita per 75% alkoholaj kotonaj buloj.

5.Endogena RNase Ĉiuj histoj enhavas endogenajn enzimojn, do rapida frostado de histoj kun likva nitrogeno estas la plej bona maniero por redukti degradadon.La likva nitrogena stokado/muelanta metodo estas ja maloportuna, sed ĝi estas la sola maniero por histoj kun altaj niveloj de endogenaj enzimoj.

6. RNA-provaĵoj RNA-eltiraj produktoj povas enhavi spurojn de RNase-poluado.

7. Plasmida eltiro Plasmida eltiro ofte uzas Rnase por degradi RNA, kaj la resta Rnase devus esti digestita kun Proteinase K kaj ĉerpita per PCI.

8. RNA-stokado Eĉ se ĝi estas stokita ĉe malalta temperaturo, spurkvantoj de RNase kaŭzos RNA-degeneron.La plej bona solvo por longdaŭra konservado de RNA estas salo/alkohola suspendo, ĉar alkoholo malhelpas ĉian enzimecan agadon ĉe malaltaj temperaturoj.

9. Kiam katjonoj (Ca, Mg) enhavas ĉi tiujn jonojn, hejtado je 80C dum 5 minutoj kaŭzos RNA esti fendita, do se RNA devas esti varmigita, la konserva solvo devas enhavi kelatan agenton (1mM Natria Citrato, pH 6.4).

10. Enzimoj uzataj en postaj eksperimentoj povas esti poluitaj de RNase.

10 Konsiloj por RNA Eltiro

1: Rapide malhelpi RNase-agadon.Provaĵoj estas rapide frostigitaj post kolekto, kaj RNazo estas inaktivigita per rapida operacio dum lizo.

2: Elektu taŭgan eltiran metodon por histo kun alta ribozima enhavo, kaj adipoza histo estas plej bone uzi la metodon enhavantan fenolon.

3: Antaŭdira kvalito postulas Nordan, cDNA-biblioteka konstruo postulas altan integrecon, kaj RT-PCR kaj RPA (Ribonuclease-protekta analizo) ne postulas altan integrecon.RT-PCR postulas altan purecon (enziminhibitorestaĵoj).

4: Plena homogenigo estas la ŝlosilo por plibonigi rendimenton kaj redukti degeneron.

5: Kontrolu la integrecon de RNA-elektroforez-detekto, 28S: 18S = 2: 1 estas kompleta signo, 1: 1 ankaŭ estas akceptebla por la plej multaj eksperimentoj.

6: Forigo de DNA por RT-PCR, tabelanalizo Plej bone estas uzi Dnase I por forigi DNA.

7: Redukti la poluadon de eksogenaj enzimoj - enzimoj ne povas esti importitaj de ekstere.

8: Koncentrante malaltan koncentriĝan nuklean acidon, oni devas aldoni kunprecipitan reakciilon.Sed malhelpi la kunprecipitanton enhavantan enzimojn kaj DNA-poluadon.

9: Plene solvu la RNA, se necese, varmigu ĉe 65C dum 5 minutoj.

taŭga konservada metodo

Ĝi povas esti stokita ĉe –20C por mallonga tempo, kaj ĉe –80C dum longa tempo.La unua paŝo en plibonigo de RNA-rendimentoj estas ekkompreni ke la RNA-enhavo de malsamaj provaĵoj multe varias.Alta abundo (2-4ug/mg) kiel hepato, pankreato, koro, meza abundo (0.05-2ug/mg) kiel cerbo, embrio, reno, pulmo, timuso, ovario, malalta abundo (<0.05ug/mg) mg) kiel veziko, osto, graso.

1: Lizi ĉelojn por liberigi RN - se RNA ne estas liberigita, la rendimento estos reduktita.Elektra homogenigo funkcias pli bone ol aliaj homogenigmetodoj, sed eble ankaŭ devas esti kombinita kun aliaj metodoj, kiel ekzemple likva nitrogenmaĉado, enzimeca digestado (Lizozimo/Liticase)

2: Optimumigo de la eltira metodo.La plej grandaj problemoj kun fenol-bazitaj metodoj estas nekompleta tavoliĝo kaj parta RNA-perdo (la supernatant ne povas esti tute forigita).Nekompleta tavoliĝo ŝuldiĝas al alta nuklea acido kaj proteina enhavo, kiu povas esti solvita pliigante la kvanton de lisato uzita aŭ reduktante la kvanton de specimeno.Paŝo de kloroforma eltiro estis aldonita al la adipoza histo.RNA-perdo povas esti reduktita per malantaŭa pumpado aŭ forigante la organikan tavolon sekvitan per centrifugado.La plej granda problemo kun koloncentrifug-bazitaj metodoj estas troa specimeno.

Klasikaj Eltiraj Konsiloj

1. Fenola purigo: Aldonu egalan volumon de 1:1 Fenolo/Kloroformo kaj miksu vigle dum 1-2 minutoj.Centrifugu al alta rapideco dum 2 minutoj.Zorge forigu la supernatante (80-90%).Neniam alvenu al la meza tavolo.Egala volumeno de la reagsolvo povas esti aldonita al Fenolo/Kloroformo kaj la supernatante forigita.La du supernatantes povas esti miksitaj kune por nuklea acida precipitaĵo por plibonigi la rendimenton.Ne estu tro milda dum miksado, kaj ne provu forigi la tutan supernatanton.

2. Lavado kun 70-80% etanolo: Dum lavado, la nuklea acido devas esti suspendita por certigi, ke la resta salo estas forlavita.Samtempe, tuj post verŝado de la etanolo, centrifugu tre rapide dum kelkaj sekundoj, kaj poste forigu la restan etanolon per pipeto.Solvu post stari ĉe ĉambra temperaturo dum 5-10 minutoj.

11. Eltiro de specialaj organizoj

1. Fibra histo: La ŝlosilo al RNA-eltiro de fibrosa histo kiel koro/skeleta muskolo estas tute interrompi la histon.Ĉi tiuj histoj havas malaltan ĉelan densecon, do la kvanto de RNA per unuopezo de histo estas malalta, kaj plej bone estas uzi kiel eble plej multe da komenca kvanto.Nepre mueli la histon ĝisfunde sub frostiĝaj kondiĉoj.

2. Histoj kun alta enhavo de proteino/graso: enhavo de cerbo/vegeta graso estas alta.Post PCI-ekstraktado, la supernatant enhavas blankajn flokulojn.La supernatante devas esti re-ekstraktita kun kloroformo.

3. Histoj kun alta enhavo de nuklea acido/ribozima: la lieno/timo havas altan enhavon de nuklea acido kaj ribozima.Mueli histon sub frostigaj kondiĉoj sekvitaj de rapida homogeniĝo povas efike malaktivigi ribozimojn.Tamen, se la lisato estas tro viskoza (pro alta enhavo de nuklea acido), la PCI-ekstraktado ne povos tavoligi efike;aldoni pli da lisato povas solvi ĉi tiun problemon.Multoblaj PCI-ekstraktadoj povas forigi pli restan DNA.Se blanka precipitaĵo formiĝas tuj post aldonado de alkoholo, ĝi indikas DNA-poluadon.Re-ekstraktado kun acida PCI post dissolvo povas forigi DNA-poluadon.

4. Planta histo: Planta histo estas pli kompleksa ol besta histo.Ĝenerale, plantoj estas muelitaj sub likvaj nitrogenkondiĉoj, do RNA-degenero de endogenaj enzimoj estas nekutima.Se la degenerproblemo ne estas solvita, ĝi estas preskaŭ certe kaŭzita de malpuraĵoj enhavitaj en la specimeno.La malpuraĵoj enhavitaj en multaj plantoj kondukos al restaĵoj, kaj la kialo de restaĵoj ofte estas ĉar tiuj malpuraĵoj havas iujn similecojn kun RNA: vi precipitas kaj mi precipitas, kaj vi adsorbas kaj mi adsorbas.Ĉi tiuj karakterizaĵoj determinas ke ili estas tre fortaj enziminhibitoroj.

Nuntempe, komercaj RNA-ekstraktaj reakciiloj povas esti adaptitaj al preskaŭ ĉiuj bestaj histoj kun malgrandaj alĝustigoj, sed ekzistas malmultaj komercaj RNA-ekstraktaj reakciiloj kiuj povas esti taŭgaj por la plej multaj plantaj histoj.Feliĉe, Foregene povas provizi specialanplantaj RNA-ekstraktadoj, ni havasPlant Total RNA-Izola ilaro, Plant Total RNA-Izola ilaro Plus.Ĉi-lasta estas speciale desegnita por plantoj kun alta polisakarido kaj polifenola enhavo.Por RNA-ekstraktado, rimarkoj de laboratoriouzantoj estas precipe bonaj.

12. La efiko de specimena frosto kaj degelo La frostita specimeno povas esti pli granda, kaj ĝi devas esti tranĉita antaŭ ol esti uzata por RNA-eltiro.Provaĵoj tendencas degeli (eble parte) dum tranĉado.Frostigitaj specimenoj eble devas esti pesitaj antaŭ RNA-ekstraktado, kaj degelo certe okazos dum ĉi tiu procezo.Foje, la degelo de la specimeno ankaŭ okazas dum la likva nitrogena muelado;aŭ la frostigita specimeno estas rekte aldonita al la lisato sen likva nitrogena muelado, kaj degelo certe okazos antaŭ la kompleta homogeniĝo.Eksperimentoj montris ke frosta histo estas pli ema al RNA-degenero dum degelo ol freŝa histo.La verŝajna kialo: La frostig-degelo procezo interrompas strukturojn ene de la ĉelo, faciligante endogenajn enzimojn veni en rektan kontakton kun la RNA.

13. Juĝo de RNA-kvalito Kutime, elektroforezo estas uzata por juĝi la integrecon de RNA, kaj A260/A280 estas uzata por juĝi la purecon de RNA.En teorio, sendifekta RNA havas rilatumon de 28S:18S = 2.7:1, kaj la plej multaj datenoj emfazas la rilatumon de 28S:18S = 2:1.Fakte, preskaŭ neniu el la RNA ĉerpita el specimenoj krom ĉeloj estas en proporcio 2:1 (ĉi tio estis akirita per la Agilent Bioanalyzer).

La elektroforezrezultoj de RNA estas tuŝitaj de multaj faktoroj, inkluzive de sekundara strukturo, elektroforezkondiĉoj, specimena ŝarĝo, grado de saturiĝo de EB, ktp. Uzu indiĝenan elektroforezon por detekti RNA kaj uzi DNA-Signon kiel kontrolon.Se la 28S ĉe 2kb kaj la 18S ĉe 0.9kb estas klaraj, kaj 28S: 18S > 1, la integreco povas renkonti la postulojn de la plej multaj postaj eksperimentoj.

A260/A280 estas indikilo, kiu kaŭzis multan konfuzon.Antaŭ ĉio, necesas klarigi la originan signifon de ĉi tiu indikilo por nukleaj acidoj: pura RNA, ĝia A260/280 = ĉirkaŭ 2,0.Pura RNA estas la "kaŭzo" kaj A260/A280 = 2 estas la "efiko".Nun ĉiuj uzas A260/A280 kiel 'kaŭzon', pensante ke "se A260/A280 = 2, tiam RNA estas pura", kio nature kondukas al konfuzo.

Se vi interesiĝas, vi povas aldoni iom da reakciilo, kiu estas ofte uzata en eltiro, kiel fenolo, guanidina isotiocianato, PEG, ktp., al via RNA-specimeno, kaj tiam mezuri la rilatumon A260/A280.La realeco estas, ke multaj el la reakciiloj uzitaj por RNA-ekstraktado, same kiel multaj malpuraĵoj en la provaĵo, sorbas ĉirkaŭ A260 kaj A280, influante A260/A280.

La plej instrua aliro nuntempe estas skani RNA-provaĵojn en la 200-300 nm-intervalo.La kurbo de pura RNA havas la sekvajn trajtojn: la kurbo estas glata, A230 kaj A260 estas du fleksiaj punktoj, A300 estas proksima al 0, A260/A280 = proksimume 2.0, kaj A260/A230 = proksimume 2.0.Se skandatenoj ne estas haveblaj, la A260/A230-proporcio ankaŭ devas esti determinita, ĉar tiu rilatumo estas pli sentema al transdono de ĉiuj malpuraĵoj kiuj influas la enzimecan reagon.Konsideru la linearan gamon de la aparato (0.1–0.5 por A260).

Estas du aliaj utilaj fenomenoj: la rilatumo estos ĉirkaŭ 0,3 pli malalta kiam A260/A280 estas mezurita en akvo;dum la proporcio mezurita en 10 mM EDTA estas proksimume 0.2 pli alta ol tiu mezurita en 1 mM EDTA.

Rilataj produktoj:

Ĉina Fabrikisto kaj Provizanto de Totala RNA-Izola Ilaro |Foregene (foreivd.com)

RNA izolado serio Provizantoj kaj Fabriko |Ĉinaj RNA-izolaj serioj Fabrikistoj (foreivd.com)

RNA-izola serio - Foregene Co., Ltd. (foreivd.com)