Specifeco de detekto
Plejofte, la celo de enkondukdezajno estas maksimumigi la specifecon de PCR.Ĉi tio estas determinita de la pli-malpli antaŭvidebla influo de multaj variabloj.Unu grava variablo estas la sekvenco ĉe la 3′fino de la enkonduko.
Grave, PCR-analizoj dizajnitaj por specifeco pli konservas altan efikecon en larĝa dinamika gamo, ĉar la analizo ne produktas nespecifajn plifortigajn produktojn, tiel konkurante kun PCR-reakciiloj aŭ malhelpante la ĉefan plifortigan reagon.
Kompreneble, en kelkaj kazoj, specifeco ne estas la plej grava, ekzemple, kiam la celo estas kvantigi proksime rilatajn sed malsamajn patogenojn, specialaj dezajno, optimumigo kaj konfirmnormoj estas postulataj.
La fanda kurbo estas norma metodo por taksi la specifecon de amplikonoj, almenaŭ laŭ ĉu plifortigi ununuran celon.Tamen, oni devas emfazi, ke la fandaj kurboj povas esti misgvidaj ĉar, ekzemple, ili povas esti trafitaj per la kombinitaj efikoj de suboptimumaj enkondukoj kaj malaltaj ŝablonkoncentriĝoj.
P5 |La fanda kurbo montras la Tm-ŝanĝojn akiritajn de du detektoj de malsamaj kvantoj de du celaj DNA.
A. Ĉe pli altaj koncentriĝoj (ad)), ekzistas neniu evidenta amordimero post kiam la qPCR-mezurado estas kompletigita.Ĉar la ŝablonkoncentriĝo malpliiĝas al 50 kopioj (e), nespecifa produkto komencas aperi kaj iĝas la nura produkto ĉe la plej malalta koncentriĝo (f).
B. La testo registris la samajn Tms ĉe ĉiuj celkoncentriĝoj, kaj ekzistis neniu evidenta primer-dimero eĉ ĉe la plej malalta koncentriĝo (5 kopioj).Dum uzado de ĉi tiuj du detektmetodoj, neniuj plifortigaj produktoj estis detektitaj en NTCoj.
P5 montras la dissolvkurbojn akiritajn kun provaĵoj en kiuj la ŝablono ĉeestas ĉe malsamaj koncentriĝoj.P 5a montras ke ĉe la du plej malaltaj koncentriĝoj, la Tms de la nespecifaj plifortproduktoj produktitaj estas pli malaltaj ol tiu de la specifaj amplikonoj.
Evidente, ĉi tiu detekta metodo ne povas esti fidinde uzata por detekti celojn, kiuj ekzistas en malaltaj koncentriĝoj.
Interese, NTC-oj, t.e., specimenoj kun neniu DNA entute, ne registris (nespecifajn) plifortigajn produktojn, indikante ke fona genomic DNA povas partopreni en nespecifa plifortigo/polimerigo.
Foje tiaj fonaj enkondukoj kaj nespecifa plifortigo ne povas esti solvigitaj, sed estas ofte eble dizajni detektmetodon kiu ne havas nespecifan plifortigon en iu ŝablonkoncentriĝo kaj NTC (P 5b).
Ĉi tie, eĉ registri la plifortigon de la celkoncentriĝo kun Cq de 35 produktos specifan dissolvkurbon.Simile, NTCoj montris neniujn signojn de nespecifa plifortigo.Foje, la detektkonduto povas esti dependa de la patrinlikvaĵo, kaj nur nespecifa plifortigo estas detektita en certaj bufrokunmetaĵoj, kiuj povas esti rilatitaj al malsamaj Mg2+ koncentriĝoj.
Stabileco de detekto
La optimumigo de Ta estas utila paŝo en la empiria konfirmo kaj optimumiga procezo de qPCR-detekto.Ĝi disponigas rektan indikon de la fortikeco de la enkonduko aro montrante la temperaturon (aŭ temperaturintervalon) kiu produktas la plej malsupran Cq sen plifortigado de la NTC.
La du ĝis kvarobla diferenco en sentemo eble ne estas grava por homoj kun alta mRNA-esprimo, sed por diagnozaj testoj, ĝi povas signifi la diferencon inter pozitivaj kaj malveraj negativaj rezultoj.
La Ta-trajtoj de qPCR-enkondukoj povas varii multe.Kelkaj provoj ne estas tre fortikaj, kaj se ili ne estas faritaj sub la optimuma Ta valoro de la enkondukoj, ili rapide kolapsos.
Tio estas grava ĉar tiu speco de detekto ofte estas problema en la reala mondo, kaj la pureco de la provaĵo, la koncentriĝo de DNA, aŭ la ĉeesto de alia DNA eble ne estas optimuma.
Krome, la cela kopinombro povas varii en larĝa gamo, kaj la reakciiloj, plastaj iloj aŭ instrumentoj povas esti diferencaj de tiuj uzitaj dum aranĝado de la testo.
P6|La temperaturgradiento montras la malsaman fortikecon de PCR-detekto.
A. Uzu la Sensifast SYBR mastermix de Bioline (katalognombro BIO-98050) por plenumi PCR sur cDNA preparita el homa cerba RNA.
B. Uzu la CFX qPCR-instrumenton de Bio-Rad por registri la plifortigan mapon kaj dissolvkurbon de apaleno (NM_033207, F: GCCATGGAGGAAAGTGACAGACC, R: CTCATGTGTGGGTGATCCTAGG).
C. Plifortiga grafeo kaj fanda kurbo de ACSBG1 (NM_015162.4, F: CTACACTTCCGGCACCACTGG, R: GTCCACGTGATATTGTCTTGACTCAG).
D. Plifortiga grafikaĵo kaj dissolva kurbo de GFAP (NM_002055.5, F: TGGAGAGGAAGATTGAGTCGCTGG, R: CGAACCTCCTCCTCGTGGATCTTC).
E. Cqs registrita ĉe malsamaj kalciaj temperaturoj, montrante la diferencon en Cq registrita sub 7C temperaturgradiento.
P 6 montras tipan rezulton de nedezirinda testo, kie qPCR estis farita uzante gradienton Tas inter 59C kaj 67C (P 6a), uzante enkondukojn por tri homaj cerb-specifaj genoj.
Oni povas vidi de la plifortiga grafeo, ke Opalin-enkondukoj estas malproksimaj de idealaj ĉar ilia optimuma Ta-intervalo estas tre mallarĝa (Figuro 6b), tio estas, Cqs estas vaste disigitaj, rezultigante Cqs signife komparitaj kun sia optimuma Cqs Low.
Tiu detektometodo estas malstabila kaj povas konduki al suboptimuma plifortigo.Tial ĉi tiu paro de enkondukoj devas esti restrukturita.Krome, la fandkurba analizo (enmetita) montras ke la specifeco de tiu detekta metodo ankaŭ povas esti problema, ĉar la fanda kurbo de ĉiu Ta estas malsama.
La ACSBG1-detektometodo montrita en P 6c estas pli fortika ol la Opalin-detektometodo supre, sed ĝi estas ankoraŭ malproksima de ideala, kaj verŝajne ĝi povas esti plibonigita.
Tamen, ni emfazas, ke ne estas necesa ligo inter fortikeco kaj specifeco, ĉar la dissolva kurbo produktita de ĉi tiu detekta metodo montras la saman pintvaloron en ĉiuj Tas (enmetita).
Aliflanke, la fortikectesto estas multe pli tolerema, produktante similajn Cqs en larĝa gamo de Tas, kiel en la GFAP-testo montrita en P 6d.
La diferenco en Cqs akiritaj en la sama intervalo de 8 celsiusgradoj estas malpli ol 1, kaj la dissolva kurbo (enmetita) konfirmas la detektajn trajtojn en ĉi tiu temperaturo.Indas noti, ke la kalkulita Tas kaj la reala Ta gamo povas esti tre malsamaj.
Estas multaj gvidlinioj desegnitaj por helpi esploristojn desegni efikajn enkondukojn, la plej multaj el kiuj baziĝas sur long-establitaj reguloj kaj multe da atento estis pagita al la 3′fino de la enkondukoj.Estas ofte rekomendite inkludi G aŭ C ĉe la 3' fino kaj du G aŭ C bazojn (GC-krampo), sed ne pli ol du el la lastaj 5 bazoj.
En la praktiko, ĉi tiuj reguloj povas gvidi esploristojn, sed ili ne estas nepre ĝustaj en ĉiuj cirkonstancoj.
P7 |La 3′fino de la enkonduko havas nur malmulte da efiko al specifeco aŭ efikeco.
A. La pozicio de la enkondukoj por la homa HIF-1α (NM_181054.2) geno.
B. Uzu Agilent Brilliant III SYBR Verdan patrinan likvoron (Kat. n-ro 600882) por plifortigi ses testajn erojn.
C. Plifortiga grafeo kaj fandanta kurbo registrita per la CFX qPCR-instrumento de Bio-Rad kaj 3′finaj enkondukoj.NTCoj estas montritaj en ruĝa.
D. Cqs rekordo de ĉiu testa ero
Ekzemple, la rezulto en P 7 kontraŭdiras la 3′finan regulon.Ĉiuj dezajnoj produktas baze la samajn rezultojn, kun nur du enkondukkombinaĵoj kondukantaj al nespecifa plifortigo en NTC.
Tamen, ni ne povas subteni la efikon de la GC-klipo, ĉar en ĉi tiu kazo, uzi A aŭ T kiel maksimume 30 bazojn ne reduktas specifecon.
Testo C, kie la F-enkonduko finiĝas en GGCC, registris Cqs en NTCoj, indikante ke oni eble volas eviti ĉi tiujn sekvencojn ĉe la 30-fino.Ni emfazas, ke la nura maniero por determini la plej bonan 3′finan sekvencon de enkonduka paro estas taksi kelkajn kandidatojn enkondukojn eksperimente.
Plifortiga efikeco
Grave, kvankam nespecifa PCR-detekto neniam povas iĝi specifa, la plifortiga efikeco povas esti alĝustigita kaj maksimumigita laŭ multaj malsamaj manieroj ŝanĝante la enzimon, patrinlikvaĵon, aldonaĵojn, kaj biciklajn kondiĉojn.
Por taksi la efikecon de PCR-detekto, plej bone estas uzi serian diluon de 10 aŭ 5 fojojn la celita nuklea acido, tio estas, la "norma kurba metodo".
Se PCR-amplikonoj aŭ sintezaj DNA-celoj estas uzitaj por generi norman kurbon, seriaj diluoj de tiuj celoj devus esti miksitaj kun konstanta kvanto de fona DNA (kiel ekzemple genoma DNA).
P8 |Dilua kurbo por taksi la efikecon de PCR.
A. Uzu enkondukojn por HIF-1: F: AAGAACTTTTAGGCCGCTCA kaj R: TGTCCTGTGGTGACTTGTCC kaj Agilent's Brilliant III SYBR Green mastermix (katalogonumero 600882) por PCR kaj fandaj kurbaj kondiĉoj.
B. 100 ng RNA estis inverse transskribita, diluita 2 fojojn, kaj serio diluitaj cDNA specimenoj estis diluitaj 5 fojojn al 1 ng homa genomic DNA.La fandanta kurbo estas montrita en la enmetita.
C. La RT-reago, diluo kaj seria diluo estis ripetitaj por la dua cDNA-provaĵo, kaj la rezultoj estis similaj.
P 8 montras du normajn kurbojn, uzante la saman detektan metodon sur du malsamaj cDNA-specimenoj, la rezulto estas la sama efikeco, ĉirkaŭ 100%, kaj la R2-valoro ankaŭ estas simila, tio estas, la grado de taŭgeco inter la eksperimentaj datumoj kaj la regresa linio aŭ la datumoj Grado de lineareco.
La du normaj kurboj estas kompareblaj, sed ne ĝuste la samaj.Se la celo estas precize kvantigi la celon, oni devas rimarki, ke estas neakcepteble disponigi kopian nombrokalkulon sen klarigi la necertecon.
P9 |Mezura necerteco asociita kun kvantigo uzante norman kurbon.
A. Uzu primerojn por GAPDH (NM_002046) por plenumi PCR kaj fandantajn kurbkondiĉojn.F: ACAGTTGCCATGTAGACC kaj R: TAACTGGTTGAGCACAGG kaj Sensifast SYBR-majstra miksaĵo de Bioline (katalonombro BIO-98050).
B. Plifortiga diagramo, fandanta kurbo kaj norma kurbo registrita per la CFX qPCR-instrumento de Bio-Rad.
C. Norma kurba grafikaĵo kaj 95% konfidenca intervalo (CI).
D. La kopinombro kaj 95% konfidenca intervalo de la tri Cq-valoroj derivitaj de la dilua kurbo.
P 9 montras ke por optimumigita testo, la eneca ŝanĝebleco de ununura norma kurbo estas proksimume 2 fojojn (95% konfidencintervalo, minimumo al maksimumo), kiu povas esti la plej malgranda ŝanĝebleco kiu povas esti atendita.
Rilata produkto:
Animal Tissue Direct PCR-kompleto
Afiŝtempo: Sep-30-2021
