En qPCR-eksperimentoj, primerdezajno ankaŭ estas gravega ligo.Ĉu la enkondukoj taŭgas aŭ ne estas proksime rilata al ĉu la plifortiga efikeco atingas la normon, ĉu la plifortigitaj produktoj estas specifaj, kaj ĉu la eksperimentaj rezultoj estas haveblaj.
Do kiel plibonigi la specifecon de qPCR-primeraĵo?Alta plifortiga efikeco?
Hodiaŭ, ni kondukos vin por desegni qPCR-enkondukojn kune, kaj lasos qPCR-anprojekton fariĝi efika scipovkapablo en eksperimentoj.
Dum desegnado de qPCR-enkondukoj, kutime atentu la sekvajn punktojn: enkondukoj devas esti desegnitaj trans intronoj kiel eble plej multe, la produktolongo devas esti 100-300 bp, la Tm-valoro devus esti kiel eble plej proksima al 60 °C, kaj la kontraŭfluaj kaj kontraŭfluaj enkondukoj devus esti kiel eble plej proksimaj, kaj la fino de la enkonduko estu G aŭ C, ktp.
1. Dezajno de enkondukoj enhavantaj introjn
Dum dizajnado de qPCR-enkondukoj, elektado de enkondukoj dizajnitaj trans intronoj povas malhelpi la gDNA-ŝablonon esti plifortigita, kaj la produktoj estas ĉiuj derivitaj de la plifortigo de cDNA, tiel eliminante la influon de gDNA-poluado.
2. Primer-longo
La amorlongo estas ĝenerale inter 18-30 nt, kaj la longo de la plifortiga produkto devus esti kontrolita inter 100-300 bp kiel eble plej multe.
Se la enkonduko estas tro mallonga, ĝi kondukos al nespecifa plifortigo, kaj se ĝi estas tro longa, ĝi facile formos sekundaran strukturon (kiel ekzemple harpingla strukturo).Se la plifortiga produkto estas tro longa, ĝi ne taŭgas por la reago de polimerazo, kiu influos la efikecon de PCR-ampligado.
3. GC-enhavo kaj Tm-valoro
La GC-enhavo de enkondukoj devus esti kontrolita inter 40% kaj 60%.Se ĝi estas tro alta aŭ tro malalta, ĝi ne favoras komenci la reagon.La GC-enhavo de la antaŭaj kaj inversaj enkondukoj devus esti proksima al la sama por akiri la saman Tm-valoron kaj kalsontemperaturon.
La Tm-valoro devus esti inter 55-65 °C laŭeble, ĝenerale ĉirkaŭ 60 °C, kaj la Tm-valoro de la kontraŭflue kaj laŭflue estu kiel eble plej proksima, prefere ne pli ol 4 °C.
4. Evitu elekti A ĉe la 3′ fino de la enkonduko
Kiam la 3′ fino de la enkonduko estas misagordita, ekzistas grandaj diferencoj en la sintezefikeco de malsamaj bazoj.Kiam la lasta bazo estas A, ĝi ankaŭ povas komenci ĉensintezon eĉ en la kazo de miskongruo, kaj kiam la lasta bazo estas T Kiam , la efikeco de miskongrua indukto estas tre reduktita.Tial, provu eviti elekti A ĉe la 3′ fino de la enkonduko, kaj estas pli bone elekti T.
Se ĝi estas enketo enkonduko, la 5′ fino de la enketo ne povas esti G, ĉar eĉ kiam ununura G-bazo estas ligita al la FAM-fluoreska raportistogrupo, G ankaŭ povas estingi la fluoreska signalo elsendita fare de la FAM-grupo, rezultigante malverajn negativajn rezultojn.Aperi.
5. Baza distribuo
La distribuado de la kvar bazoj en la enkonduko estas prefere hazarda, evitante pli ol 3 sinsekvajn G aŭ C ĉe la 3′ fino, kaj pli ol 3 sinsekvajn.G aŭ C estas facile generi pariĝon en la GC-riĉa sekvencoregiono.
6. La unua dezajnoregiono devus eviti kompleksajn sekundarajn strukturojn.
La sekundara strukturo formita de la ununura fadeno de la plifortiga produkto influos la glatan progreson de PCR.Antaŭdirante ĉu ekzistas sekundara strukturo en la celsekvenco anticipe, provu eviti ĉi tiun regionon en la dezajno de enkondukoj.
7. La enkondukoj mem kaj inter la enkondukoj devus provi eviti sinsekvajn komplementajn bazojn.
Ne povas ekzisti sinsekva 4-baza komplementeco inter la enkonduko mem kaj la enkonduko.La enkonduko mem ne devus havi komplementan sekvencon, alie ĝi faldos sin por formi harpinglan strukturon, kiu influos la kalzigan kombinaĵon de la enkonduko kaj la ŝablono.
Komplementaj sekvencoj ne povas ekzisti inter kontraŭfluaj kaj kontraŭfluaj enkondukoj.Komplementeco inter enkondukoj produktos primerdimerojn, kiuj reduktos PCR-efikecon kaj eĉ influos kvantan precizecon.Se la enkonduk-dimero kaj harpinglaj strukturoj estas neeviteblaj, la △G-valoro ne devus esti tro alta (devus esti malpli ol 4.5 kcal/mol).
8. La enkondukoj plifortigas la celspecifan produkton.
La finfina celo de qPCR-detekto estas kompreni la abundon de la celgeno.Se nespecifa plifortigo okazas, la kvantigo estos malpreciza.Tial, post kiam la enkondukoj estas dizajnitaj, ili devas esti testitaj per BLAST, kaj la specifeco de la produktoj estas komparita en la sekvencodatumbazo.
Poste, ni prenas la homan GAS6 (Growth arest specific 6) genon kiel ekzemplon por desegni qPCR-enkondukojn.
01 demanda geno
Homo GAS6tra NCBI.Ĉi tie, ni devus atenti kompari la gennomon kaj speciojn por certigi, ke ili estas konsekvencaj.
02 Trovu la gensekvencon
(1) Se la celsekvenco estas genoma DNA, elektu la unuan, kiu estas la genoma DNA-sekvenco de la geno.
(2) Se la celsekvenco estas mRNA, elektu la duan.Post eniro, alklaku "CDS" en la suba tabelo.La bruna fonsekvenco estas la koda sekvenco de la geno.
03 Dezajnu enkondukojn
Enigu la Primer-BLAST-interfacon
Enigu la genan sekvencon aŭ la sekvencon en Fasta-formato supre maldekstre, kaj plenigu la koncernajn parametrojn.

Alklaku "Akiru enkondukojn" kaj NCBI aperos por diri al vi, ke tia parametra elekto estos plifortigita al aliaj splisaj variantoj.Ni povas kontroli la malsamajn splisajn variantojn kaj sendi ilin por akiri la taŭgan enkondukan paron (kiel montrite en la suba figuro).Ĉi tiu procezo povas daŭri dekojn da sekundoj por funkcii.
La kalciaj temperaturoj de ĉi tiuj amorparoj estas tute ĉirkaŭ 60 °C.Laŭ la celo de la eksperimento, elektu enkondukojn kun modera longeco, bona specifeco kaj malpli da memkompletigo de la enkondukoj por la eksperimento, kaj la sukcesprocento estas sufiĉe alta!
04Primer-specifeca konfirmo
Fakte, krom desegnado de enkondukoj, Primer-Blast ankaŭ povas taksi la enkondukojn, kiujn ni mem desegnis.Revenu al la paĝo pri desegnado, enigu la enkondukojn, kiujn ni desegnis kontraŭflue, kaj aliaj parametroj ne estos ĝustigitaj.Post submetado, vi povas vidi ĉu la paro de enkondukoj ankaŭ ekzistas sur aliaj genoj.Se ĉiuj ili estas montrataj sur la geno, kiun ni volas pligrandigi, indikante, ke la specifeco de ĉi tiu paro de enkondukoj estas bonega!(Ekzemple, ĉi tio estas la nura rezulto de la pridemando!)

05 Primera kvalito-juĝo
Kia enkonduko estas la "perfekta" enkonduko, kiu kombinas "plifortigan efikecon ĝis norma", "plifortigitajn produktajn karakterizaĵojn" kaj "fidindajn eksperimentajn rezultojn"?
Plifortiga efikeco

fandanta kurbo
La plifortiga efikeco de la enkondukoj atingas 90%-110%, kio signifas, ke la plifortiga efikeco estas bona, kaj la fandanta kurbo havas ununuran pinton kaj kutime Tm>80 °C, kio signifas, ke la plifortiga specifeco estas bona.
 
Rilataj Produktoj:
Real Time PCR Easy–SYBR GREEN I
Real Time PCR Easy-Taqman