Bazo pri dezajno de komenca (99% problemoj povas esti solvitaj)
1. Primera longo: La lernolibro postulas 15-30bp, kutime proksimume 20bp.La reala kondiĉo estas pli bone esti 18-24bp por certigi la specifecon, sed ju pli longa des pli bona, tro longa enkonduko ankaŭ reduktos la specifecon kaj reduktos la rendimenton.
2. Primera plifortiga daŭro: 200-500bp taŭgas, kaj la fragmento povas esti vastigita al 10kb sub specifaj kondiĉoj.
3. Primera bazo: La enhavo de G + C devus esti 40-60%, tro malmulte da G + C plifortiga efiko ne estas bona, tro da G + C estas facile aperi nespecifaj bandoj.ATGC estas plej bone distribuita hazarde, evitante aretojn de pli ol 5 purinaj aŭ pirimidinnukleotidoj.Multi-gc por la 5′ fino kaj mezaj sekvencoj por pliigi stabilecon, eviti riĉan GC ĉe la 3′ fino, neniu GC por la lastaj 3 bazoj, aŭ neniu GC por 3 el la lastaj 5 bazoj.
4. Evitu sekundaran strukturon en enkondukoj, kaj evitu komplementadon inter du enkondukoj, precipe komplementon ĉe la 3 'fino, alie amordimero estos formita kaj nespecifaj plifortigitaj bandoj estos generitaj.
5. La bazoj ĉe la 3 'fino de enkondukoj, precipe la lastaj kaj antaŭlastaj bazoj, devus esti strikte parigitaj por eviti PCR-malsukceson pro neparigitaj finaj bazoj.
6. Primeroj havas aŭ povas esti aldonitaj kun taŭgaj fendaj lokoj, kaj la plifortigita celsekvenco devus prefere havi taŭgajn fendajn lokojn, kio estas tre utila por fenda analizo aŭ molekula klonado.
7. Specifeco de enkondukoj: enkondukoj devus havi neniun evidentan homologion kun aliaj sekvencoj en la nukleacida sekvencodatumbazo.
8. Lernu uzi programaron: PP5, Oligo6, DNAstar, Vector NTI, primer3 (Ĉi tiu interreta dezajno funkcias plej bone).
La ĉi-supra enhavo povas solvi almenaŭ 99% de unuaj projektproblemoj.
Kontrolu la detalojn de la enkonduka dezajno
1. Primera longo
Ĝenerala amorlongo estas 18 ~ 30 bazoj.Ĝenerale, la plej grava faktoro determinanta la kalsontemperaturon de la enkonduko estas la longo de la enkonduko.La kalcia temperaturo de amoro estas ĝenerale elektita (Tm-valoro -5℃), kaj iuj rekte uzas Tm-valoron.La sekvaj formuloj povas esti uzataj por malglate kalkuli la kalsontemperaturon de enkondukoj.
Kiam la longo de enkonduko estas malpli ol 20bp: [4(G+C)+2(A+T)]-5℃
Kiam la longo de enkonduko estas pli granda ol 20bp: 62.3℃+0.41℃(%GC)-500/longo-5℃
Krome, multaj programoj ankaŭ povas esti uzataj por kalkuli la kalzitan temperaturon, la kalkulprincipo estos malsama, do foje la kalkulita valoro povas havi malgrandan breĉon.Por optimumigi PCR-reagojn, la plej mallongaj enkondukoj, kiuj certigas kalciajn temperaturojn de ne malpli ol 54℃, estas uzataj por la plej bona efikeco kaj specifeco.
Entute, enkondukspecifeco pliiĝas je faktoro de kvar por ĉiu kroma nukleotido, tiel ke la minimuma enkonduklongo por la plej multaj aplikoj estas 18 nukleotidoj.La supra limo de amorlongo ne estas tre grava, ĉefe rilata al reakcia efikeco.Pro entropio, des pli longa la enkonduko, des pli malalta estas la rapideco ĉe kiu ĝi kalzis por ligi al la cela DNA por formi stabilan duoble-senhelpan ŝablonon por DNA-polimerazo por ligi.
Kiam oni uzas programaron por desegni enkondukojn, la longo de enkondukoj povas esti determinita laŭ TM-valoro siavice, precipe por enkondukoj de fluoreskeca kvanta PCR, TM=60℃ aŭ tiel devus esti kontrolita.
2.GC enhavo
Ĝenerale, la enhavo de G+C en enkonduksekvencoj estas 40% ~ 60%, kaj GC-enhavo kaj Tm-valoro de paro de enkondukoj devus esti kunordigitaj.Se la enkonduko havas seriozan GC aŭ AT tendencon, taŭga kvanto de A, T aŭ G kaj C-vosto povas esti aldonita al la 5 'fino de la enkonduko.
3. Rekiga temperaturo
La kalcia temperaturo devas esti 5℃ pli malalta ol la senĉeniga temperaturo.Se la nombro da komencaj bazoj estas malgranda, la kalcia temperaturo povas esti pliigita taŭge, kio povas pliigi la specifecon de PCR.Se la nombro da bazoj estas granda, la kalcia temperaturo povas esti reduktita taŭge.La kalcia temperaturdiferenco inter paro da enkondukoj de 4℃ ~ 6℃ ne influos la PCR-rendimenton, sed ideale la kalcia temperaturo de paro da enkondukoj estas la sama, kiu povas varii inter 55℃ ~ 75℃.
4. Evitu la sekundaran strukturan areon de la plifortiga ŝablono
Plej bone estas eviti la sekundaran strukturregionon de la ŝablono kiam elektas la plifortigitan fragmenton.La stabila sekundara strukturo de la celfragmento povas esti antaŭdirita kaj taksita per rilata komputila programaro, kiu estas helpema por ŝablonelekto.Eksperimentaj rezultoj montras ke la vastiĝo ofte estas malsukcesa kiam la libera energio (△G) de la regiono por esti vastigita estas malpli ol 58.6lkJ/mol.
5. Miskongruo kun cela DNA
Kiam la plifortigita cela DNA-sekvenco estas granda, enkonduko povas ligi al multoblaj partoj de la cela DNA, rezultigante multoblajn grupojn aperantajn en la rezulto.Ĉi-foje necesas uzi la testadon de la programaro BLAST, retejo:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.Elektu Vicigi du sekvencojn (bl2seq).
Alglui enkondukajn sekvencojn al zono 1 kaj celajn DNA-sekvencojn al zono 2 estas interŝanĝebla, kaj BLAST kalkulas komplementajn, kontraŭsencajn kaj aliajn eblecojn, do uzantoj ne bezonas rimarki ĉu ambaŭ ĉenoj estas sensencaj ĉenoj.Vi ankaŭ povas enigi la GI-numeron se vi konas la GI-numeron de la sekvenco en la datumbazo, do vi ne devas alglui grandan sekcion de la sekvenco.Fine, alklaku Align ĉe 3 por vidi ĉu la enkonduko havas plurajn homologajn lokojn en la cela DNA.
6. Primera terminalo
La 3 'fino de la enkonduko estas kie la etendaĵo komenciĝas, do gravas malhelpi miskongruojn komenci tie.La 3 'fino ne devus esti pli ol 3 sinsekvaj G aŭ C, ĉar tio igos la enkondukon esti erare ekigita en la G+C-riĉiga sekvencoregiono.La 3 'fino ne povas formi ajnan sekundaran strukturon, krom en specialaj PCR (AS-PCR) reagoj, la 3' fino de la enkonduko ne povas esti misagordita.Ekzemple, se la kodoregiono estas plifortigita, la 3 'fino de enkonduko ne devus esti finita ĉe la tria pozicio de kodono, ĉar la tria pozicio de kodono estas ema degeneri, kiu influos la specifecon kaj efikecon de plifortigo.Kiam vi uzas aneksajn enkondukojn, raportu al la kodona uzotabelo, atentu biologian preferon, ne uzu aneksajn enkondukojn ĉe la 3′ fino, kaj uzu pli altan koncentriĝon de enkondukoj (1uM-3uM).
7. Sekundara strukturo de enkondukoj
La enkondukoj mem ne devus havi komplementajn sekvencojn, alie la enkondukoj mem faldos en harpinglaj strukturoj, kaj tiu sekundara strukturo influos la ligadon de enkondukoj kaj ŝablonoj pro stera malhelpo.Se artefarita juĝo estas uzata, la kontinuaj komplementaj bazoj de enkondukoj mem ne devus esti pli grandaj ol 3bp.Ne devus ekzisti komplementeco inter la du enkondukoj, precipe la komplementa interkovro de la 3 'fino devus esti evitita por malhelpi la formadon de enkondukaj dimeroj.Ĝenerale, devus ekzisti ne pli ol 4 sinsekvaj bazhomologio aŭ komplementeco inter paro de enkondukoj.
8. Aldonu markilojn aŭ lokojn
La 5 'fino havas nur malmulte da efiko al plifortiga specifeco kaj povas tial esti modifita sen influado de plifortiga specifeco.La modifo de primer 5 'fino inkludis: aldonante enzimo restrikto ejo;Etikedita biotino, fluoreskeco, digoksino, Eu3+, ktp. Enkonduku proteinajn ligantajn DNA-sekvencojn;Enkonduko de mutaciolokoj, enmetado kaj mankanta mutaciosekvencoj kaj enkondukado de reklamantaj sekvencoj, ktp. La ekstraj bazoj pli-malpli influos la efikecon de plifortigo kaj pliigos la ŝancon de primer-dimerformado, sed kelkaj koncedoj devas esti faritaj por la sekva paŝo.Kromaj sekvencoj kiuj ne ekzistas sur la celsekvenco, kiel ekzemple restriktejoj kaj reklamantosekvencoj, povas esti aldonitaj al la 5′ fino de la enkonduko sen influado de specifeco.Tiuj sekvencoj ne estas inkluditaj en la kalkulo de enkondukaj Tm-valoroj, sed devus esti testitaj pri komplementeco kaj interna sekundara strukturo.
9. Subklonoj
Plejofte, PCR estas nur prepara klonado, kaj tiam ni devas subkloni la celfragmenton en diversajn vektorojn, do ni devas desegni pliajn bazojn por la sekva operacio en la PCR-paŝo.
Kelkaj sekvencoj dizajnitaj por subklonado estas resumitaj malsupre.
Restrikta endonukleaza restriktoloko estis aldonita
Aldonado de enzimaj restriktejoj estas la plej ofte uzata metodo por subklonado de PCR-produktoj.Ĝenerale, la fendetejo estas ses bazoj, krom la 5 'fino de la fendetejo bezonas aldoni 2 ~ 3 protektajn bazojn.Tamen, la nombro da protektaj bazoj postulataj de malsamaj enzimoj estas malsama.Ekzemple, SalⅠ postulas neniun protektan bazon, EcoRⅤ postulas 1 protektan bazon, NotⅠ postulas 2 protektajn bazojn, kaj Hind Ⅲ postulas 3 protektajn bazojn.
LIC aldonas la voston
La plena nomo de LIC estas Ligation-Independent klonado, klonadmetodo inventita fare de Navogen specife por sia parto de la pET-vektoro.La pET-portilo preparita per LIC-metodo havas ne-komplimentajn 12-15-bazajn ununurajn fadenajn gluigajn finaĵojn, kiuj kompletigas la respondajn gluiĝemajn finojn sur la cela enigfragmento.Por plifortigaj celoj, la enkonduko 5′ sekvenco de la enigita fragmento devus kompletigi la LIC-vektoron.La 3′→5′ ekstrankta agado de T4 DNA-polimerazo povas formi ununuran fadenan gluiĝeman finon sur la enigita fragmento post mallonga tempo.Ĉar la produkto nur povas esti formita de la reciproka kalciado de la preta enmetfragmento kaj la vektoro, ĉi tiu metodo estas tre rapida kaj efika, kaj ĝi estas direktita klonado.
Direktita TA-klono aldonas voston
TA-klonado estis nekapabla celi la fragmenton en vektoron, tiel ke pli posta Invitrogen lanĉis vektoron kiu povis celi klonadon, kiu enhavis kvar elstarajn bazajn GTGGS ĉe unu fino.Tial, en la dezajno de PCR-enkondukoj, komplementaj sekvencoj devus esti aldonitaj sekve, tiel ke fragmentoj povas esti "orientitaj".
Se vi mankas tempo, vi povas provi rektan sintezon, kombinante la genon kun la vektoro, kio estas tio, kion ni nomas ET-gena sintezo ĉe musekuloj.
D. In-Fusion-klonada metodo
Neniu ligazo bezonata, neniu longa reago bezonata.Tiel longe kiel sekvenco ĉe ambaŭ finoj de la linearigita vektoro estas lanĉita En la dezajno de enkondukoj, tiam la PCR-produkto kaj la linearigita vektoro estas aldonitaj en la enfuzian enzimsolvaĵon enhavanta BSA kaj metita ĉe ĉambra temperaturo dum duonhoro, la transformo povas esti farita.Ĉi tiu metodo estas precipe taŭga por granda voluma konvertiĝo.
10. Kunfandi primer
Foje, nur limigitaj sinsekvenformoj estas konataj pri enkondukdezajno.Ekzemple, se nur la aminoacidsekvenco estas konata, la kunfandanta enkonduko povas esti dizajnita.Fuzia enkonduko estas miksaĵo de malsamaj sekvencoj reprezentantaj ĉiujn malsamajn bazeblecojn kiuj ĉifras ununuran aminoacidon.Por pliigi specifecon, vi povas raporti al la kodona uzotabelo por redukti aneksadon laŭ bazuzaj preferoj de malsamaj organismoj.Hipoksantino povas esti parigita kun ĉiuj bazoj por redukti la kalsontemperaturon de la enkonduko.Ne uzu la aneksitajn bazojn ĉe la 3′ fino de la enkonduko ĉar la kalciado de la lastaj 3 bazoj ĉe la 3′ fino sufiĉas por komenci PCR ĉe la malĝusta loko.Pli altaj enkondukaj koncentriĝoj (1μM ĝis 3μM) estas uzitaj ĉar enkondukoj en multaj aneksaj miksaĵoj ne estas specifaj por la celŝablono.
PCR-krudmaterialojkontrolo
1. Primera kvanto
La koncentriĝo de ĉiu amoro estas 0,1 ~ 1 umol aŭ 10 ~ 100 pmol.Pli bone estas produkti la bezonatan rezulton kun la plej malalta kvanto de primero.Alta koncentriĝo de enkonduko kaŭzos miskongruon kaj nespecifan plifortigon, kaj pliigos la eblecon de formado de dimeroj inter enkondukoj.
2. Unua koncentriĝo
La koncentriĝo de enkondukoj influas la specifecon.La optimuma enkonduka koncentriĝo estas ĝenerale inter 0.1 kaj 0.5μM.Pli altaj enkondukaj koncentriĝoj kondukas al plifortigo de nespecifaj produktoj.
3. Kuraciga temperaturo de amoro
Alia grava parametro por enkondukoj estas la fandtemperaturo (Tm).Tio estas la temperaturo kiam 50% de la enkondukoj kaj komplementaj sekvencoj estas reprezentitaj kiel duoble-senhelpaj DNA-molekuloj.Tm estas postulata por agordi PCR-anneadan temperaturon.Ideale, la kalcia temperaturo estas sufiĉe malalta por certigi efikan kalcigadon de la enkondukoj kun la celsekvenco, sed sufiĉe alta por redukti nespecifan ligadon.Racia kalcia temperaturo de 55 ℃ ĝis 70 ℃.Kuracia temperaturo estas ĝenerale fiksita 5℃ pli malalta ol Tm de amoro.
Ekzistas pluraj formuloj por fiksi Tm, kiuj multe varias depende de la formulo uzita kaj la sekvenco de enkondukoj.Ĉar la plej multaj formuloj disponigas laŭtaksan Tm-valoron, ĉiuj kalciaj temperaturoj estas nur deirpunkto.Specifeco povas esti plibonigita analizante plurajn reagojn kiuj laŭstadie levas la kalsontemperaturon.Komencu sub la taksita Tm-5℃, kaj iom post iom pliigu la kalcigan temperaturon en pliigo de 2℃.Pli alta kalcia temperaturo reduktos la formadon de amordimeroj kaj nespecifaj produktoj.Por plej bonaj rezultoj, la du enkondukoj devus havi proksimumajn Tm-valorojn.Se la Tm-diferenco de enkondukaj paroj estas pli ol 5℃, la enkondukoj montros signifan malveran komencon uzante pli malaltan kalsontemperaturon en la ciklo.Se la du enkondukoj Tm estas malsamaj, agordu la kalsontemperaturon je 5℃ pli malalta ol la plej malalta Tm.Alternative, por pliigi specifecon, kvin cikloj povas esti faritaj unue ĉe kalciaj temperaturoj dizajnitaj por pli alta Tm, sekvitaj per la ceteraj cikloj ĉe kalciaj temperaturoj dizajnitaj por pli malalta Tm.Ĉi tio permesas partan kopion de la celŝablono esti akirita sub mallarĝaj kondiĉoj.
4. Primer pureco kaj stabileco
La norma pureco de kutimaj enkondukoj estas adekvata por la plej multaj PCR-aplikoj.La forigo de benzoil- kaj isobutilil-grupoj per sensaligado estas minimuma kaj tial ne influas PCR.Kelkaj aplikoj postulas purigon forigi iujn ajn ne-plenlongajn sekvencojn en la sintezprocezo.Tiuj senpintigitaj sekvencoj okazas ĉar la efikeco de DNA-sinteza kemio ne estas 100%.Ĉi tio estas cirkla procezo kiu uzas ripetajn kemiajn reagojn kiam ĉiu bazo estas aldonita por fari DNA de 3′ ĝis 5′.Vi povas malsukcesi en ambaŭ cikloj.Pli longaj enkondukoj, aparte tiuj pli grandaj ol 50 bazoj, havas grandan proporcion de stumpigitaj sekvencoj kaj povas postuli purigon.
La rendimento de enkondukoj estas tuŝita de la efikeco de sinteza kemio kaj puriga metodo.Biofarmaciaj kompanioj, kiel Citologio kaj Shengong, ĉiuj uzas minimuman OD-unuon por certigi la totalan produktadon de oligonukleozido.Propraj enkondukoj estas senditaj en seka pulvora formo.Plej bone estas resolvi la enkondukojn en TE tiel ke la fina koncentriĝo estas 100μM.TE estas pli bona ol dejonigita akvo ĉar la pH de akvo ofte estas acida kaj kaŭzos la hidrolizon de oligonukleozidoj.
La stabileco de enkondukoj dependas de konservadkondiĉoj.Seka pulvoro kaj solvita enkondukoj devas esti stokitaj je -20 ℃.Enkondukoj solvitaj en TE ĉe koncentriĝoj pli grandaj ol 10μM povas esti stabile stokitaj je -20℃ dum 6 monatoj, sed nur povas esti stokitaj ĉe ĉambra temperaturo (15℃ ĝis 30℃) dum malpli ol 1 semajno.Sekaj pulvoraj enkondukoj povas esti stokitaj je -20 C dum almenaŭ 1 jaro kaj ĉe ĉambra temperaturo (15 C ĝis 30 C) ĝis 2 monatoj.
5. Enzimoj kaj iliaj koncentriĝoj
Nuntempe, la Taq DNA-polimerazo uzata estas esence la geninĝenierada enzimo sintezita de koliformaj bakterioj.La kvanto de enzimo necesa por katalizi tipan PCR-reagon estas proksimume 2.5U (rilatas al la totala reagvolumeno de 100ul).Se la koncentriĝo estas tro alta, ĝi povas konduki al nespecifa plifortigo;se la koncentriĝo estas tro malalta, la kvanto de sinteza produkto estos reduktita.
6. Kvalito kaj koncentriĝo de dNTP
La kvalito de dNTP estas proksime rilatita al la koncentriĝo kaj la efikeco de PCR-plifortigo.La dNTP-pulvoro estas granula, kaj ĝia ŝanĝebleco perdas sian biologian aktivecon se ĝi estas nedece stokita.dNTP-solvo estas acida, kaj devas esti uzata en alta koncentriĝo, kun 1M NaOH aŭ 1M Tris.HCL-bufrosolvo por ĝustigi sian PH al 7.0 ~ 7.5, malgranda kvanto de sub-pakaĵo, frostita stokado ĉe -20℃.Multoblaj frostigo-degelo degradis dNTP.En PCR-reago, dNTP devus esti 50 ~ 200 umol/L.Precipe oni devas atenti la koncentriĝon de la kvar DNTPS egalaj (egala mole-preparo).Se la koncentriĝo de iu el ili diferencas de la aliaj (pli alta aŭ pli malalta), miskongruo estos kaŭzita.Tro malalta koncentriĝo reduktos la rendimenton de PCR-produktoj.dNTP povas kombini kun Mg2+ kaj redukti la koncentriĝon de libera Mg2+.
7. Ŝablono (cela geno) nuklea acido
La kvanto kaj puriga grado de ŝablono nuklea acido estas unu el la ŝlosilaj ligoj por la sukceso aŭ fiasko de PCR.La tradiciaj DNA-purigmetodoj kutime uzas SDS kaj proteazon K por digesti kaj forigi specimenojn.La ĉefaj funkcioj de SDS estas: solvi lipidojn kaj proteinojn sur la ĉela membrano, tiel detruante la ĉelan membranon solvante membranproteinojn, kaj disociigi nukleajn proteinojn en la ĉelo, SDS ankaŭ povas kombini kun proteinoj kaj precipiti;Proteazo K povas hidrolizi kaj digesti proteinojn, precipe histonojn ligitajn kun DNA, kaj tiam uzi organikan solventan fenolon kaj kloroformon por ĉerpi proteinojn kaj aliajn ĉelkomponentojn, kaj uzi etanolon aŭ izopropilan alkoholon por precipiti nuklean acidon.La ĉerpita nuklea acido povas esti utiligita kiel ŝablono por PCR-reagoj.Por ĝeneralaj klinikaj detektaj specimenoj, rapida kaj simpla metodo povas esti uzata por dissolvi ĉelojn, lizi patogenojn, digesti kaj forigi proteinojn de kromosomoj por liberigi celgenojn, kaj rekte uzata por PCR-plifortigo.RNA-ŝablonekstraktado kutime uzas guanidinizotiocianaton aŭ proteaz K-metodon por malhelpi RNazon degradi RNA.
8.Mg2+ koncentriĝo
Mg2+ havas signifan efikon al la specifeco kaj rendimento de PCR-plifortigo.Ĝenerale PCR-reago, kiam la koncentriĝo de diversaj dNTP estas 200umol/L, la taŭga koncentriĝo de Mg2+ estas 1.5 ~ 2.0mmol/L.Mg2+-koncentriĝo estas tro alta, la reagospecifo malpliiĝas, nespecifa plifortigo okazas, tro malalta koncentriĝo reduktos la agadon de Taq DNA-polimerazo, rezultigante la redukton de reagoproduktoj.
Magneziaj jonoj influas plurajn aspektojn de PCR, kiel ekzemple DNA-polimerazo-agado, kiu influas rendimenton;Alia ekzemplo estas amora kalciado, kiu influas specifecon.dNTP kaj ŝablono ligas al magneziojono, reduktante la kvanton de libera magneziojono necesa por enzimagado.La optimuma magneziojonkoncentriĝo varias por malsamaj enkondukaj paroj kaj ŝablonoj, sed tipa PCR komencanta koncentriĝo kun 200μM dNTP estas 1.5mM (noto: Por realtempa kvanta PCR, uzu 3 ĝis 5mM magneziojon solvo kun fluoreska sondilo).Pli altaj koncentriĝoj de liberaj magneziojonoj pliigas rendimenton, sed ankaŭ pliigas nespecifan plifortigon kaj malpliigas fidelecon.Por determini la optimuman koncentriĝon, magneziojon-titradoj estis faritaj en pliigoj de 0.5mM de 1mM ĝis 3mM.Por redukti la dependecon de magneziojonoptimumigo, Platinum Taq DNA-polimerazo povas esti uzita.Platena Taq DNA-polimerazo povas konservi funkcion en pli larĝa gamo de magneziojonkoncentriĝoj ol Taq DNA-polimerazo kaj tial postulas malpli optimumigo.
9. Pcr-promociaj aldonaĵoj
Optimumigo de kalcia temperaturo, amordezajno kaj magneziojonkoncentriĝo sufiĉas por tre specifa plifortigo de la plej multaj ŝablonoj;tamen, kelkaj ŝablonoj, inkluzive de tiuj kun alta GC-enhavo, postulas kromajn mezurojn.Aldonaĵoj kiuj influas la fandan temperaturon de DNA disponigas alian manieron plibonigi produktospecifecon kaj rendimenton.Plena malnaturado de la ŝablono estas postulata por plej bonaj rezultoj.
Krome, la sekundara strukturo malhelpas primer-ligadon kaj enzimetendon.
PCR-aldonaĵoj, inkluzive de formamido, DMSO, glicerino, betaino kaj PCRx Enhancer Solution, plibonigas plifortigon.Ilia ebla mekanismo devas redukti la degeltemperaturon, tiel helpante la kalson de enkondukoj kaj helpante DNA-polimerazetendaĵon tra la sekundara strukturregiono.PCRx Solution havas aliajn avantaĝojn.Minimuma magneziojonooptimumigo estas postulata kiam uzata kun Platinum Taq DNA-polimerazo kaj Platinum Pfx DNA-polimerazo.Tiel, la Platinum-tekniko estas kombinita kun la aldonaĵo por pliigi specifecon reduktante la dependecon de la tria aliro, magnezia jona optimumigo.Por plej bonaj rezultoj, la koncentriĝo de aldonaĵoj devus esti optimumigita, precipe DMSO, formamido, kaj glicerolo, kiuj malhelpas Taq DNA-polimerazon.
10. Varma ekfunkciigo
Varma starta PCR estas unu el la plej gravaj metodoj por plibonigi PCR-specifecon aldone al bona komenca dezajno.Kvankam la optimuma plilongiga temperaturo de Taq DNA-polimerazo estas 72℃, la polimerazo restas aktiva ĉe ĉambra temperaturo.Tiel, nespecifaj produktoj estas produktitaj kiam la tena temperaturo estas pli malalta ol la kalcia temperaturo dum la preparado de la PCR-reago kaj komence de la termika ciklo.Post kiam formitaj, ĉi tiuj nespecifaj produktoj estas efike plifortigitaj.Varm-komenca PCR estas precipe efika kiam la ejoj uzitaj por enkondukdezajno estas limigitaj per la loko de genetikaj elementoj, kiel ekzemple ejo-direktitaj mutacioj, esprimo klonado, aŭ konstruado kaj manipulado de genetikaj elementoj uzitaj por DNA-inĝenierado.
Ofta metodo por limigi la agadon de Taq DNA-polimerazo devas prepari PCR-reagsolvon sur glacio kaj meti ĝin en antaŭvarmigitan PCR-aparaton.Ĉi tiu metodo estas simpla kaj malmultekosta, sed ĝi ne kompletigas la agadon de la enzimo kaj tial ne tute forigas la plifortigon de nespecifaj produktoj.
Termika pretigo prokrastas DNA-sintezon malhelpante esencan komponenton ĝis la PCR-aparato atingas denaturan temperaturon.La plej multaj manaj termikaj inicmetodoj, inkluzive de malfrua aldono de Taq DNA-polimerazo, estas maloportunaj, precipe por alt-rendimentaj aplikoj.Aliaj termikaj preparmetodoj uzas vaksŝildon por enfermi esencan komponenton, inkluzive de magneziojonoj aŭ enzimoj, aŭ por fizike izoli reaktivajn komponentojn, kiel ekzemple ŝablonoj kaj bufroj.Dum la termika ciklo, la diversaj komponentoj estas liberigitaj kaj miksitaj kune kiam la vakso degelas.Kiel la mana varma startmetodo, la vaksoŝilda metodo estas maloportuna kaj inklina al poluado kaj ne taŭgas por altproduktaj aplikoj.
Platena DNA-polimerazo estas oportuna kaj efika por aŭtomata varma starta PCR.Platena Taq DNA-polimerazo konsistas el rekombina Taq DNA-polimerazo kombinita kun unuklona antikorpo kontraŭ Taq DNA-polimerazo.La antikorpoj estas formulitaj per PCR por malhelpi enzimaktivecon dum longedaŭra temperaturtenado.Taq DNA-polimerazo estis liberigita en la reakcion dum la 94℃ izolado de la denatura paŝo, restarigante plenan polimerazaktivecon.Kontraste al kemie modifita Taq DNA-polimerazo por termika inico, Platena enzimo ne postulas longedaŭran izolitecon je 94℃ (10 ĝis 15 minutoj) por aktivigi la polimerazon.Kun PlatinumTaq DNA-polimerazo, 90% de Taq DNA-polimerazo-agado estis restarigitaj post 2 minutoj je 94℃.
11. Nesto-PCR
Sinsekvaj preterpasas de plifortigo uzante nestitajn enkondukojn povas plibonigi specifecon kaj sentemon.La unua raŭndo estas norma plifortigo de 15 ĝis 20 cikloj.Malgranda frakcio de la komenca plifortiga produkto estis diluita 100 ĝis 1000 fojojn kaj aldonita al la dua raŭndo de plifortigo dum 15 ĝis 20 cikloj.Alternative, la komenca plifortigita produkto povas esti grandigita per ĝela purigo.Nestita enkonduko estas uzita en la dua raŭndo de plifortigo, kiu povas ligi al la celsekvenco ene de la unua enkonduko.La uzo de nestita PCR reduktas la eblecon de plifortigo de multoblaj celejoj ĉar ekzistas malmultaj celsekvencoj komplementaj al ambaŭ aroj de enkondukoj.La sama tutsumo de cikloj (30 ĝis 40) kun la samaj enkondukoj plifortigis la nespecifajn ejojn.Nesta PCR pliigas la sentemon de limigitaj celsekvencoj (ekz., maloftaj mrnas) kaj plibonigas la specifecon de malfacila PCRS (ekz. 5′ VETURO).
12. Malkreskanta PCR
Malkreskanta PCR plibonigas specifecon uzante streĉajn kalcikondiĉojn por la unuaj malmultaj cikloj de PCR.La ciklo komenciĝas ĉe kalcia temperaturo proksimume 5℃ pli alta ol la taksita Tm, tiam ĉiu ciklo estas reduktita je 1℃ ĝis 2℃ ĝis la kalcia temperaturo estas sub Tm 5℃.Nur la celŝablono kun la plej alta homologio estos plifortigita.Ĉi tiuj produktoj daŭre disetendiĝas en postaj cikloj, forpuŝante la plifortigitajn nespecifajn produktojn.Malkreskanta PCR estas utila por metodoj kie la grado da homologio inter enkonduko kaj celŝablono ne estas konata, kiel ekzemple AFLP DNA-fingrospurado.
Rilataj PCR-ajoj
La 2× PCR HeroTMMiksaĵsistemo havas pli altan toleremon al PCR-inhibitoroj ol la ordinara PCR Mix-sistemo, kaj povas facile elteni PCR-plifortigon de diversaj kompleksaj ŝablonoj.La unika reagsistemo kaj alt-efikeca Taq Hero igas la PCR-reagon havi pli altan plifortigan efikecon, specifecon kaj sentemon.
Pli alta plifortiga efikeco
Ĝi havas 5'→3' DNA-polimerazian agadon kaj 5'→3' eksonukleazaktivecon, sen 3'→5' eksonukleazan agadon.
Real Time PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit
Specifa - optimumigita bufro kaj varmega Taq-enzimo povas malhelpi nespecifan plifortigon kaj amoran dimerformadon
Alta sentemo—povas detekti malaltajn kopiojn de ŝablono
La ilaro uzas unikan Foregene inversan transskriban reakciilon kaj Foregene HotStar Taq DNA Polymerase kombinitan kun unika reagsistemo por efike plibonigi la plifortigan efikecon kaj specifecon de la reago.
Afiŝtempo: majo-09-2023
