• PCR estas metodo uzita por plifortigi DNA de malgranda kvanto de DNA-ŝablono.RT-PCR uzas inversan transskribon por produkti DNA-ŝablonon de RNA-fonto kiu tiam povas esti plifortigita.
• PCR kaj RT-PCR estas tipe finpunktoreagoj, dum qPCR kaj RT-qPCR uzas la kinetikon de la indico de produktosintezo dum la PCR-reago por kvantigi la kvanton de ŝablono ĉeestanta.
• Pli novaj metodoj, kiel ekzemple cifereca PCR, disponigas absolutan kvantigon de la komenca DNA-ŝablono, dum metodoj kiel ekzemple izoterma PCR reduktas la bezonon de multekosta ekipaĵo por disponigi fidindajn rezultojn.

Polimeraza ĉena reago (PCR) estas relative simpla kaj vaste uzita molekula biologia tekniko por plifortigi kaj detekti DNA kaj RNA-sekvencojn.Kompare al tradiciaj metodoj de DNA-klonado kaj plifortigo, kiuj ofte povas daŭri tagojn, PCR postulas nur kelkajn horojn.PCR estas tre sentema kaj postulas minimuman ŝablonon por detekto kaj plifortigo de specifaj sekvencoj.Bazaj PCR-metodoj plu progresis de simpla DNA kaj RNA-detekto.Malsupre, ni provizis superrigardon pri la malsamaj PCR-metodoj kaj la reakciiloj, kiujn ni provizas ĉe Enzo Life Sciences por viaj esploraj bezonoj.Ni celas helpi sciencistojn rapide aliri PCR-reagilojn por uzi en ilia venonta esplorprojekto!

PCR

Por norma PCR, ĉio, kion vi bezonas, estas DNA-polimerazo, magnezio, nukleotidoj, enkondukoj, la DNA-ŝablono por esti amplifita kaj termociklilo.La PCR-mekanismo estas same simpla kiel sia celo: 1) duoble-senhelpa DNA (dsDNA) estas varme denaturita, 2) enkondukoj vicigas al la ununuraj DNA-fadenoj, kaj 3) la enkondukoj estas etenditaj per DNA-polimerazo, rezultigante du kopiojn de la. origina DNA-fadeno.La denaturado, kalciado, kaj plilongiga procezo super serio de temperaturoj kaj tempoj estas konata kiel unu ciklo de plifortigo (Fig. 1).

Ĉiu paŝo de la ciklo devus esti optimumigita por la ŝablono kaj enkondukaro uzataj.Ĉi tiu ciklo estas ripetita proksimume 20-40 fojojn, kaj la plifortigita produkto tiam povas esti analizita, tipe per agarose ĝelo (Fig. 2).

Ĉar PCR estas tre sentema metodo kaj tre malgrandaj volumoj estas postulataj por ununuraj reagoj, la preparado de majstra miksaĵo por pluraj reagoj estas rekomendita.La majstra miksaĵo devas esti bone miksita kaj tiam dividita per la nombro da reagoj, certigante ke ĉiu reago enhavos la saman kvanton de enzimo, dNTPoj, kaj enkondukoj.Multaj provizantoj, kiel Enzo Life Sciences, ankaŭ ofertas PCR-miksaĵojn, kiuj jam enhavas ĉion krom enkondukoj kaj la DNA-ŝablono.

Guanine/Citozin-riĉaj (GC-riĉaj) regionoj reprezentas defion en normaj PCR-teknikoj.GC-riĉaj sekvencoj estas pli stabilaj ol sekvencoj kun pli malalta GC-enhavo.Krome, GC-riĉaj sekvencoj tendencas formi sekundarajn strukturojn, kiel ekzemple harpinglaj bukloj.Kiel rezulto, GC-riĉaj duoblaj fadenoj malfacilas tute apartigi dum la denatura fazo.Sekve, DNA-polimerazo ne povas sintezi la novan fadenon sen malhelpo.Pli alta denaturigtemperaturo povas plibonigi tion, kaj alĝustigoj direkte al pli alta kalcia temperaturo kaj pli mallonga kalcia tempo povas malhelpi la nespecifan ligadon de GC-riĉaj enkondukoj.Kromaj reakciiloj povas plifortigi la plifortigon de GC-riĉaj sekvencoj.DMSO, glicerolo, kaj betaino helpas interrompi la sekundarajn strukturojn kiuj estas kaŭzitaj de GC-interagoj kaj tiel faciligas la apartigon de la duoblaj fadenoj.

Hot Start PCR

Nespecifa plifortigo estas problemo kiu povas okazi dum PCR.Plej multaj DNA-polimerazoj, kiuj estas uzataj por PCR, funkcias plej bone ĉe temperaturoj ĉirkaŭ 68 °C ĝis 72 °C.La enzimo povas tamen esti aktiva ĉe pli malaltaj temperaturoj, kvankam en pli malalta grado.Ĉe temperaturoj multe sub la kalcia temperaturo, enkondukoj povas ligi nespecife kaj konduki al nespecifa plifortigo, eĉ se la reago estas starigita sur glacio.Tio povas esti malhelpita uzante polimerazinhibitorojn kiuj disiĝas de la DNA-polimerazo nur post kiam certa temperaturo estas atingita, tial la esprimon varma starta PCR.La inhibitoro povas esti antikorpo kiu ligas la polimerazon kaj denaturiĝas ĉe la komenca denatura temperaturo (95 °C tipe).

Alta Fideleca Polimerazo

Dum DNA-polimerazoj plifortiĝas sufiĉe precize al la origina ŝablonsekvenco, eraroj en nukleotida egalado povas okazi.Misagordoj en aplikoj kiel ekzemple klonado povas rezultigi stumpigitajn transskribaĵojn, kaj mistradukitajn aŭ neaktivajn proteinojn laŭflue.Por eviti ĉi tiujn miskongruojn, polimerazoj kun "pruvlega" agado estis identigitaj kaj integrigitaj en la laborfluon.La unua provlega polimerazo, Pfu, estis identigita en 1991 en Pyrococcus furiosus.Tiu Pfu-enzimo havas 3' ĝis 5' eksonukleazan agadon.Ĉar la DNA estas plifortigita, la eksonukleazo forigas miskongruajn nukleotidojn ĉe la 3' fino de la fadeno.La ĝusta nukleotido tiam estas anstataŭigita, kaj DNA-sintezo daŭras.La identigo de malĝustaj nukleotidsekvencoj estas bazita sur la liga afineco por la ĝusta nukleozidtrifosfato kun la enzimo, kie malefika ligado bremsas la sintezon kaj enkalkulas la ĝustan anstataŭaĵon.La provlega agado de Pfu-polimerazo rezultigas pli malmultajn erarojn en la fina sekvenco komparite kun Taq DNA-polimerazo.En la lastaj jaroj, aliaj provlegaj enzimoj estis identigitaj, kaj modifoj de la origina Pfu-enzimo estis faritaj por plue redukti la erarfrekvencon dum DNA-plifortigo.

RT-PCR

Inversa transskriba PCR, aŭ RT-PCR, permesas la uzon de RNA kiel ŝablono.Plia paŝo permesas la detekton kaj plifortigon de RNA.La RNA estas inversa transskribita en komplementan DNA (cDNA), uzante inversan transkriptazon.La kvalito kaj pureco de la RNA-ŝablono estas esencaj por la sukceso de RT-PCR.La unua paŝo de RT-PCR estas la sintezo de DNA/RNA-hibrido.Inversa transkriptazo ankaŭ havas RNase H-funkcion, kiu degradas la RNA-parton de la hibrido.La unu-fadena DNA-molekulo tiam estas kompletigita per la DNA-dependa DNA-polimeraza agado de la inversa transkriptazo en cDNA.La efikeco de la unua-fadena reago povas influi la plifortigprocezon.De ĉi tie, la norma PCR-proceduro estas uzata por plifortigi la cDNA.La ebleco ŝanĝi RNA en cDNA per RT-PCR havas multajn avantaĝojn, kaj ĝi estas ĉefe uzita por genekspresio-analizo.RNA estas unu-fadena kaj tre malstabila, kio igas ĝin malfacila labori kun.Ĝi ofte funkcias kiel unua paŝo en qPCR, kiu kvantigas RNA-transskribaĵojn en biologia provaĵo.

qPCR kaj RT-qPCR

Kvanta PCR (qPCR) kutimas detekti, karakterizi kaj kvantigi nukleajn acidojn por multaj aplikoj.En RT-qPCR, RNA-transskribaĵoj ofte estas kvantigitaj inverse transskribante ilin en cDNA unue, kiel priskribite supre, kaj tiam qPCR poste estas aranĝita.Kiel en norma PCR, DNA estas plifortigita per tri ripetaj ŝtupoj: denaturado, kalciado kaj plilongigo.Tamen, en qPCR, fluoreska etikedado ebligas la kolekton de datenoj kiam PCR progresas.Ĉi tiu tekniko havas multajn avantaĝojn pro la gamo de metodoj kaj kemioj disponeblaj.

En tinkturfarb-bazita qPCR (tipe verda), fluoreska etikedado permesas la kvantigon de la plifortigitaj DNA-molekuloj utiligante la uzon de dsDNA-liga tinkturfarbo.Dum ĉiu ciklo, la fluoreskeco estas mezurita.La fluoreskecsignalo pliiĝas proporcie al la kvanto de reproduktita DNA.Tial, la DNA estas kvantigita en "reala tempo" (Fig. 3).La malavantaĝoj al tinkturfarb-bazita qPCR estas ke nur unu celo povas esti ekzamenita samtempe kaj ke la tinkturfarbo ligos al iu ds-DNA ĉeestanta en la provaĵo.

En enket-bazita qPCR, multaj celoj povas esti detektitaj samtempe en ĉiu provaĵo, sed tio postulas optimumigon kaj dezajnon de cel-specifa enketo (j) uzita aldone al enkondukoj.Pluraj specoj de enketdezajnoj estas haveblaj, sed la plej ofta tipo estas hidrolizenketo, kiu asimilas fluoroforon kaj estingilon.Fluoreskeca resonanca energitransigo (FRET) malhelpas la emision de la fluoroforo per la estingilo dum la enketo estas sendifekta.Tamen, dum la PCR-reago, la enketo estas hidrolizita dum enkonduka etendaĵo kaj plifortigo de la specifa sekvenco al kiu ĝi estas ligita.La fendetaĵo de la sondilo apartigas la fluoroforon de la estingilo kaj rezultigas plifortigan dependan pliiĝon en fluoreskeco (Fig. 4).Tiel, la fluoreskecsignalo de enket-bazita qPCR-reago estas proporcia al la kvanto de la enketcelsekvenco ĉeestanta en la provaĵo.Ĉar enket-bazita qPCR estas pli specifa ol tinkturfarb-bazita qPCR, ĝi ofte estas la teknologio uzita en qPCR-bazitaj diagnozaj analizoj.

Izoterma Plifortigo

La PCR menciitaj supre teknikoj postulas multekostan termociklada ekipaĵo precize rampi supren kaj malsupren kamertemperaturoj por la denaturado, kalciado, kaj etendaĵoj.Kelkaj teknikoj estis evoluigitaj kiuj ne bezonas tiajn precizajn aparatojn kaj povas esti faritaj en simpla akvobano aŭ eĉ ene de la ĉeloj de intereso.Tiuj teknikoj estas kolektive nomitaj izoterma plifortigo kaj laboro bazita sur eksponenta, linia, aŭ kaskada plifortigo.

La plej konata speco de izoterma plifortigo estas buklo-mediaciita izoterma plifortigo, aŭ LAMPO.LAMPO uzas eksponencan plifortigon je 65⁰C por plifortigi ŝablon DNA aŭ RNA.Dum elfarado de LAMPO, kvar ĝis ses enkondukoj komplementaj al regionoj de la cela DNA estas uzitaj kun DNA-polimerazo por sintezi novan DNA.Du el tiuj enkondukoj havas komplementajn sekvencojn kiuj rekonas sekvencojn en la aliaj enkondukoj kaj ligas ilin, permesante ke "buklo-" strukturo formiĝos en la lastatempe sintezita DNA kiu tiam helpas enkondukan kalson en postaj preterpasas de plifortigo.LAMPO povas esti bildigita per multoblaj metodoj, inkluzive de fluoreskeco, agaroseĝelektroforezo aŭ kolorimetrio.La facileco bildigi kaj detekti la ĉeeston aŭ foreston de produkto per kolorimetrio kaj la manko de multekosta ekipaĵo postulata igis LAMP taŭga opcio por SARS-CoV-2-testado en lokoj kie klinika laboratoriotestado ne estis facile havebla, aŭ stokado kaj transporto de specimenoj. ne estis farebla, aŭ en laboratorioj kiuj antaŭe ne havis PCR-termocikladan ekipaĵon.