1. Bazaj scioj (se vi volas vidi la eksperimentan parton, bonvolu transdoni rekte al la dua parto)
Kiel derivita reago de konvencia PCR, Realtempa PCR ĉefe kontrolas la ŝanĝon de la kvanto de plifortiga produkto en ĉiu ciklo de la PCR-amplifiga reago en reala tempo per la ŝanĝo de la fluoreskeca signalo, kaj kvante analizas la komencan ŝablonon per la rilato inter la ct-valoro kaj la norma kurbo.
La specifaj datumoj de RT-PCR estasbazlinio, fluoreskeca sojlokajCt valoro.
| bazlinio: | La fluoreskecvaloro de la 3-a-15-a ciklo estas la bazlinio (bazlinio), kiu estas kaŭzita de la foja eraro de la mezurado. |
| Sojlo (sojlo): | Rilatas al la fluoreskeca detektolimo fiksita ĉe taŭga pozicio en la eksponenta kreskoregiono de la plifortiga kurbo, ĝenerale 10 fojojn la norma devio de la bazlinio. |
| CT-valoro: | Ĝi estas la nombro da PCR-cikloj kiam la fluoreskecvaloro en ĉiu reagtubo atingas la sojlon. La Ct-valoro estas inverse proporcia al la kvanto de komenca ŝablono. |
Oftaj etikedmetodoj por RT-PCR:
| metodo | avantaĝon | manko | amplekso de apliko |
| SYBR VerdaⅠ | Vasta aplikebleco, sentema, malmultekosta kaj oportuna | Unuaj postuloj estas altaj, emaj al nespecifaj grupoj | Ĝi taŭgas por kvanta analizo de diversaj celgenoj, esplorado pri genesprimo, kaj esplorado pri transgenaj rekombinaj bestoj kaj plantoj. |
| TaqMan | Bona specifeco kaj alta ripeteblo | La prezo estas alta kaj taŭgas nur por specifaj celoj. | Detekto de patogenoj, esploro pri genorezista drogo, taksado de efikeco de drogoj, diagnozo de genetikaj malsanoj. |
| molekula lumturo | Alta specifeco, fluoreskeco, malalta fono | La prezo estas alta, ĝi taŭgas nur por specifa celo, la dezajno estas malfacila kaj la prezo estas alta. | Specifa genanalizo, SNP-analizo |
2. Eksperimentaj paŝoj
2.1 Pri la eksperimenta grupiĝo- devas esti pluraj putoj en la grupo, kaj devas esti biologiaj ripetoj.
| ① | Malplena kontrolo | Uzita por detekti ĉelkreskan statuson en eksperimentoj |
| ② | Negativa kontrolo siRNA (nespecifa siRNA-sekvenco) | Montru la specifecon de RNAi-ago.siRNA povas stimuli nespecifan stresrespondon ĉe koncentriĝo de 200nM. |
| ③ | Transfekta Reakciilo-Kontrolo | Ekskludu la toksecon de la transfekta reakciilo al la ĉeloj aŭ la efikon al la esprimo de la cela geno |
| ④ | siRNA kontraŭ celgeno | Detruu la esprimon de la cela geno |
| ⑤ (laŭvola) | pozitiva siRNA | Uzita por solvi eksperimentajn sistemojn kaj funkciajn problemojn |
| ⑥ (laŭvola) | Fluoreska kontrolo siRNA | La efikeco de ĉeltransfekto povas esti observita per mikroskopo |
2.2 Principoj de komenca dezajno
| Plifortigita fragmenta grandeco | Prefere je 100-150bp |
| Primera Longo | 18-25bp |
| GC enhavo | 30%-70%, prefere 45%-55% |
| Tm valoro | 58-60℃ |
| Sekvenco | Evitu T/C kontinua;A/G kontinua |
| 3 finsekvenco | Evitu GC-riĉan aŭ AT-riĉan;la fina bazo estas prefere G aŭ C;estas plej bone eviti T |
| Komplementeco | Evitu komplementajn sekvencojn de pli ol 3 bazoj ene de la enkonduko aŭ inter du enkondukoj |
| Specifeco | Uzu eksplodan serĉon por konfirmi primer-specifecon |
①SiRNA estas speciospecifa, kaj la sekvencoj de malsamaj specioj estos malsamaj.
②SiRNA estas pakita en frostsekigita pulvoro, kiu povas esti konservita stabile dum 2-4 semajnoj ĉe ĉambra temperaturo.
2.3 Iloj aŭ reakciiloj, kiuj devas esti preparitaj anticipe
| Enkonduko (interna referenco) | Inkluzive antaŭen kaj reverson du |
| Enkondukoj (cela geno) | Inkluzive antaŭen kaj reverson du |
| Celo Si RNA (3 strioj) | Ĝenerale, la kompanio sintezos 3 striojn, kaj poste elektos unu el la tri per RT-PCR |
| Transfekta Ilaro | Lipo2000 ktp. |
| RNA Rapida Eltira Ilaro | Por RNA-ekstraktado post transfekto |
| Rapida Inversa Transskriba Ilaro | por cDNA-sintezo |
| PCR-Amplifiga Ilaro | 2×Super SYBR Verda qPCR Majstra Miksaĵo |
2.4 Koncerne la aferojn, kiujn oni devas atenti en la specifaj eksperimentaj paŝoj:
①procezo de transfekto de siRNA
1. Por tegado, vi povas elekti 24-putan platon, 12-putan platon aŭ 6-putan platon (la meza RNA-koncentriĝo proponita en ĉiu puto de 24-puta plato estas ĉirkaŭ 100-300 ng/uL), kaj la optimuma transfekta denseco de ĉeloj estas ĝis 60% -80% aŭ tiel.
2. La transfektaj paŝoj kaj specifaj postuloj estas strikte konformaj al la instrukcioj.
3. Post transfekto, specimenoj povas esti kolektitaj ene de 24-72 horoj por mRNA-detekto (RT-PCR) aŭ protein-detekto ene de 48-96 horoj (WB)
② RNA eltiro procezo
1. Malhelpi poluadon de eksogenaj enzimoj.Ĝi ĉefe inkluzivas porti maskojn kaj gantojn strikte;uzante steriligitajn pipetkonsiletojn kaj EP-tubojn;la akvo uzata en la eksperimento devas esti RNase-Libera.
2. Oni rekomendas fari dufoje kiel sugestite en la rapida eltira ilaro, kiu vere plibonigos la purecon kaj rendimenton.
3. La malŝparo likvaĵo ne devas tuŝi la RNA-kolumnon.
③ RNA-kvantigo
Post kiam la RNA estas eltirita, ĝi povas esti kvantigita rekte kun Nanodrop, kaj la minimuma legado povas esti tiel malalta kiel 10ng/ul.
④Inversa transskriba procezo
1. Pro la alta sentemo de RT-qPCR, almenaŭ 3 paralelaj putoj devus esti faritaj por ĉiu specimeno por malhelpi la postan Ct esti tro malsama aŭ la SD por esti tro granda por statistika analizo.
2. Ne frostigu kaj degelu Majstra miksaĵo ree.
3. Ĉiu tubo/truo devas esti anstataŭigita per nova pinto!Ne senĉese uzu la saman pipetpinton por aldoni specimenojn!
4. La filmo ligita al la 96-puto-plato post aldoni la specimenon devas esti glatigita per telero.Plej bone estas centrifuĝi antaŭ ol meti ĝin sur la maŝinon, por ke la likvaĵo sur la tubmuro povu flui malsupren kaj forigi aerajn vezikojn.
⑤Komuna kurba analizo
| Neniu periodo de logaritma kresko | Eble alta koncentriĝo de ŝablono |
| Neniu CT-valoro | Malĝustaj paŝoj por detektado de fluoreskaj signaloj; degradado de enkondukoj aŭ enketoj - ĝia integreco povas esti detektita per PAGE elektroforezo; nesufiĉa kvanto da ŝablono; degradado de ŝablonoj - evitante la enkondukon de malpuraĵoj kaj ripetan frostigadon kaj degelon en specimena preparado; |
| Ct>38 | Malalta plifortiga efikeco;PCR-produkto estas tro longa;diversaj reagkomponentoj estas degraditaj |
| Lineara plifortiga kurbo | Enketoj povas esti parte degeneritaj per ripetaj frosto-degelocikloj aŭ longedaŭra eksponiĝo al lumo |
| La diferenco en duobligitaj truoj estas precipe granda | La reagsolvaĵo ne estas tute fandita aŭ la reagsolvaĵo ne estas miksita;la termika bano de la PCR-instrumento estas poluita per fluoreskaj substancoj |
2.5 Pri datuma analizo
La datenanalizo de qPCR povas esti dividita en relativan kvantigon kaj absolutan kvantigon.Ekzemple, ĉeloj en la trakta grupo kompare kun ĉeloj en la kontrolgrupo,
Kiom da fojoj la mRNA de la X-geno ŝanĝiĝas, tio estas relativa kvantigo;en certa nombro da ĉeloj, la mRNA de la X-geno
Kiom da kopioj estas, tio estas absoluta kvantigo.Kutime, kion ni plej uzas en la laboratorio, estas la relativa kvanta metodo.Kutime,la 2-ΔΔct metodoestas plej uzata en eksperimentoj, do nur ĉi tiu metodo estos detale prezentita ĉi tie.
2-ΔΔct-metodo: La rezulto akirita estas la diferenco en la esprimo de la cela geno en la eksperimenta grupo rilate al la cela geno en la kontrolgrupo.Estas postulate ke la plifortigaj efikecoj de kaj la celgeno kaj la interna referenca geno estas proksimaj al 100%, kaj la relativa devio ne devus superi 5%.
La kalkulmetodo estas kiel sekvas:
Δct kontrolgrupo = ct valoro de cela geno en kontrolgrupo - ct-valoro de interna referenca geno en kontrolgrupo
Δct eksperimenta grupo = ct valoro de la cela geno en la eksperimenta grupo - ct valoro de la interna referenca geno en la eksperimenta grupo
ΔΔct=Δct eksperimenta grupo-Δct kontrolgrupo
Finfine, kalkulu la multoblon de diferenco en esprimnivelo:
Ŝanĝi Fold=2-ΔΔct (korespondanta al la excel-funkcio estas POWER)
Rilataj produktoj:
Afiŝtempo: majo-20-2023
