Ⅰ. Pliigu la sentemon de la reagsistemo:

1. Aparta altkvalita RNA:

Sukcesa cDNA-sintezo venas de altkvalita RNA.Altkvalita RNA devus certigi almenaŭ entute pli longan kaj ne enhavas inhibitorojn kiuj ne enhavas registrajn enzimojn, kiel ekzemple EDTA aŭ SDS.La kvalito de RNA determinas la maksimuman valoron de la sinsekvenformoj, kiujn vi povas transskribi al la cDNA.La ĝenerala RNA-purigmetodo estas paŝa metodo de uzado de izoocianato/acidofenolo.Por malhelpi la poluadon de RNazo, la RNA apartigita de specimeno riĉa je RNazo (kiel pankreato) postulas stokadon de formaldehido por ŝpari altkvalitan RNA, kio estas eĉ pli por longdaŭra konservado.La RNA eltirita de la rathepato estis esence degradita post unu semajno da stokado en akvo, dum la RNA eltirita de la ratlieno restis stabila post tri jaroj da stokado en akvo.Krome, transskribaĵoj pli grandaj ol 4kb estas pli sentemaj al spura RNase-degenero ol malgrandaj transskribaĵoj.Por pliigi la stabilecon de la stokada RNA-provaĵo, la RNA povas esti dissolvita en metamamino de jono, kaj estas stokita -70 °C.Tilido uzata por ŝpari RNA ne devas enhavi diferencan objekton, kiu degradas RNA.RNA, kiu estas derivita de pankreato, povas esti ŝparita en metamamino dum almenaŭ unu jaro.Kiam vi pretas uzi RNA, vi povas uzi la jenajn metodojn por precipitar RNA: aldonu NaCl al 0,2 m kaj 4 fojojn la volumeno de etanolo, metu ĉambran temperaturon dum 3-5 minutoj, kaj 10,000 × g centrifuge dum 5 minutoj.

2. Uzu inversan transkriptazon sen agado de RNaseH (RNaseH-):

RNase-inhibitoroj ofte estas aldonitaj al inversaj transskribaj reagoj por pliigi la longon kaj rendimenton de cDNA-sintezo.RNase-inhibitoro estas aldonita en la unua ĉensintezreago en la ĉeesto de bufroj kaj reduktantaj agentoj kiel ekzemple DTT ĉar la antaŭ-cDNA-sintezprocezo malnaturas la inhibitoron, tiel liberigante ligitajn RNazojn kiuj degradas RNA.Proteina RNase-inhibitoro nur malhelpas la degeneron de RNA fare de RNase A, B, C, kaj ne malhelpas RNazojn sur la haŭto, do oni zorgu ne enkonduki RNazojn el la fingroj malgraŭ la uzo de ĉi tiuj inhibitoroj.

Inversa transkriptazo katalizas la konvertiĝon de RNA en cDNA.Kaj M-MLV kaj AMV havas endogenan RNaseH-agadon aldone al sia propra polimeraza agado.RNaseH-agado konkuras kun polimeraza agado pri heterozigotaj fadenoj formitaj inter RNA-ŝablonoj kaj DNA-enkondukoj aŭ cDNA etendaĵofadenoj, kaj degradas RNA: RNA-fadenojn en DNA-kompleksoj.RNA-ŝablonoj degeneritaj per RNaseH-agado jam ne povas esti utiligitaj kiel efikaj substratoj por cDNA-sintezo, reduktante la rendimenton kaj longon de cDNA-sintezo.Tiel forigi aŭ multe redukti RNaseH-agadon de inversa transkriptazo estus de granda utilo.

SuperScriptⅡ inversa transkriptazo, MMLV inversa transkriptazo de RNaseH- kaj thermoScript inversa transkriptazo, AMV de RNaseH- donis pli plenlongan cDNA ol MMLV kaj AMV.RT-PCR-sentemo estas trafita per la kvanto de cDNA sintezita.ThermoScript estas multe pli sentema ol AMV.La grandeco de RT-PCR-produktoj estas limigita per la kapablo de inversa transkriptizo por sintezi cDNA, precipe dum klonado de pli grandaj Cdnas.Kompare kun MMLV, SuperScripⅡ signife pliigis la rendimenton de longaj RT-PCR-produktoj.La inversa transkriptazo de RNaseH- ankaŭ pliigas termikan stabilecon, do la reago povas esti farita ĉe temperaturoj pli altaj ol normalaj de 37-42 ℃.Sub la proponitaj sintezaj kondiĉoj, oligo(dT) enkondukoj kaj 10μCi [alfa-p]dCTP estis uzitaj.La totalproduktado de la unua ĉeno estis kalkulita per la TCA-pluvometodo.Plenlonga cDNA estis analizita uzante grand-ordigitan striforigon kaj kalkuladon en alkala agarosa ĝelo.

3. Pliigu la varmecan konservan temperaturon de inversa transskribo:

Pli alta tena temperaturo helpas malfermi la sekundaran strukturon de RNA kaj pliigi la rendimenton de la reago.Por la plej multaj RNA-ŝablonoj, teni la RNA kaj enkondukon je 65 °C sen bufro aŭ salo kaj tiam malvarmigi ilin rapide sur glacio eliminas la plej multajn sekundarajn strukturojn kaj permesas al la enkondukoj ligi.Tamen, kelkaj ŝablonoj daŭre havas sekundaran strukturon, eĉ post termika denaturigo.Plifortigo de tiuj malfacilaj ŝablonoj povas esti farita uzante ThermoScript inversan transkriptazon kaj metante la inversan transkriptazreagon ĉe pli altaj temperaturoj por plibonigi plifortigon.Pli altaj tenaj temperaturoj ankaŭ povas pliigi specifecon, precipe kiam cDNA-sintezo estas farita uzante gen-specifajn enkondukojn (GSPS) (vidu Ĉapitro 3).Se vi uzas GSP, certigu, ke la Tm-valoro de la enkonduko estas la sama kiel la atendata tena temperaturo.Ne uzu oligo(dT) kaj hazardajn primerojn super 60℃.Hazardaj enkondukoj devas esti tenitaj je 25 ℃ dum 10 minutoj antaŭ ol pliiĝi al 60 ℃.Aldone al uzado de pli altaj inverstransskribaj temperaturoj, specifeco povas esti plibonigita rekte transdonante la RNA-/primermiksaĵon de la 65℃ denatura temperaturo al la inversa transskribo tenanta temperaturon kaj aldonante antaŭvarmigitan 2× reagmiksaĵon (cDNA-termika inica sintezo).Tiu aliro helpas malhelpi la intermolekulan bazpariĝon kiu okazas ĉe pli malaltaj temperaturoj.Uzi PCR-instrumenton simpligas la multajn temperaturŝaltilojn necesajn por RT-PCR.

Tth varme stabiligita polimerazo funkcias kiel DNA-polimerazo en la ĉeesto de Mg2+ kaj RNA-polimerazo en la ĉeesto de Mn2+.Ĝi povas teni varmegon ĝis 65℃.Tamen, la ĉeesto de Mn2+ dum PCR reduktas fidelecon, kio igas Tth-polimerazon malpli taŭga por alta precizeca plifortigo, kiel ekzemple cDNA-klonado.Krome, Tth estas malpli efika ĉe inversa transskribo, kiu reduktas sentemon, kaj ĉar ununura enzimo povas elfari inversan transskribon kaj PCR, kontrolreagoj sen inversa transskribo ne povas esti uzitaj por distingi plifortigitajn produktojn de cDNA de tiuj de poluita genoma DNA.

4. Aldonaĵo, kiu antaŭenigas inversan transskribon:

La aldono de aldonaĵoj, inkluzive de glicerino kaj DMSO, al la unua ĉensinteza reago povas redukti la stabilecon de la duobla fadeno de nuklea acido kaj malvolvi la RNA-sekundaran strukturon.Ĝis 20% glicerino aŭ 10% DMSO povas esti aldonitaj sen influi la agadon de SuperScriptⅡ aŭ MMLV.AMV ankaŭ povas toleri ĝis 20% glicerol sen redukti agadon.Por maksimumigi la sentemon de RT-PCR en SuperScriptⅡ inversa transskriba reago, 10% glicerolo povas esti aldonita kaj izolita je 45℃.Se 1/10 el la retrotransskribo-reaga produkto estas aldonita al la PCR, la koncentriĝo de glicerolo en la plifortiga reago estas 0.4%, kio ne sufiĉas por malhelpi PCR.

5. RNaseH-pretigo:

Sentemo povas esti plibonigita traktante cDNA-sintezreagojn kun RNaseH antaŭ PCR.Por kelkaj ŝablonoj, supozeble la RNA en la cDNA-sinteza reago malhelpas la ligadon de plifortigitaj produktoj, en kiu kazo la RNaseH-traktado povas pliigi sentemon.Ĝenerale, RNaseH-traktado estas postulata por la plifortigo de relative longa plenlonga cDNA-celŝablono, kiel ekzemple tubera scherozoⅡ kun malalta kopio.Por ĉi tiu malfacila ŝablono, RNaseH plibonigis la signalon generitan de la cDNA sintezita de SuperScriptⅡ aŭ AMV.Por la plej multaj RT-PCR-reagoj, la RNaseH-traktado estas laŭvola ĉar la 95 ℃ izolita PCR-denatura paŝo tipe hidrolizas la RNA de la RNA: DNA-komplekso.

6. Plibonigitaj metodoj por detekti malgrandajn kvantojn de RNA:

RT-PCR estas precipe malfacila kiam nur malgrandaj kvantoj de RNA estas haveblaj.La aldono de glikogeno kiel portanto dum RNA-apartigo helpas pliigi la rendimenton de malgrandaj provaĵoj.RNase-libera glikogeno povas esti aldonita samtempe kun Trizol.Glikogeno estas hidrosolvebla kaj povas resti en la akvofazo kun RNA por kunlabori en posta precipitaĵo.La rekomendita koncentriĝo de RNase-libera glikogeno estas 250μg/ml por specimenoj malpli ol 50mg da histo aŭ 106 kulturitaj ĉeloj.

La aldono de acetilata BSA por inversigi transskribajn reagojn uzantajn SuperScriptⅡ povas pliigi la sentemon, kaj por malgrandaj kvantoj de RNA, reduktante la kvanton de SuperScriptⅡ kaj aldoni 40 ekzemplerojn da RnaseOut-nukleazinhibitoro povas plibonigi la detektonivelon.Se glikogeno estas uzita en RNA-apartigo, la aldono de BSA aŭ RNase-inhibitoroj por inversigi transskribajn reagojn uzantajn SuperScriptⅡ daŭre estas rekomendita.

Ⅱ. Pliigu la specifecon de RT-PCR

1. cNDA-sintezo:

Tri malsamaj metodoj povas esti uzitaj por iniciati unuan fadenan cDNA sintezon, kaj la relativa specifeco de ĉiu metodo influas la kvanton kaj specon de cDNA sintezita.

Hazarda enkonduka metodo estas la malplej specifa el la tri metodoj.Enkondukoj estas kalzitaj en multoblaj lokoj ĉie en la transskribaĵo por produkti mallongan, partlongan cDNA.Tiu metodo ofte kutimas akiri 5′ finajn sekvencojn kaj cDNA de RNA-ŝablonoj kun sekundaraj strukturaj regionoj aŭ kun finaj ejoj kiuj inversa transkriptazo ne povas reprodukti.Por akiri la plej longan cDNA, la rilatumo de enkondukoj al RNA en ĉiu RNA-provaĵo devas esti determinita empirie.La komenca koncentriĝo de hazardaj enkondukoj varias de 50 ĝis 250ng per 20μl reagsistemo.Ĉar la cDNA sintezita de totala RNA uzanta hazardajn enkondukojn estas plejparte ribosoma RNA, poli(A)+RNA estas ĝenerale elektita kiel la ŝablono.

Oligo (dT) inico estas pli specifa ol hazardaj enkondukoj.Ĝi hibridiĝas kun la poli(A) vosto trovita ĉe la 3′ fino de mRNA en la plej multaj eŭkariotaj ĉeloj.Ĉar poli(A)+RNA estas ĉirkaŭ 1% ĝis 2% de totala RNA, la kvanto kaj komplekseco de cDNA estas multe malpli ol se hazardaj enkondukoj estus uzitaj.Pro ĝia alta specifeco, oligo (dT) ĝenerale ne postulas optimumigon por RNA al enkondukproporcio kaj poli (A)+ selektado.Oni rekomendas uzi 0.5μg oligo(dT) per 20μl reagsistemo.oligo(dT)12-18 taŭgas por plej multaj RT-PCR.ThermoScript RT-PCR-Sistemo disponigas oligo(dT)20 pro sia bona termika stabileco kaj taŭgas por pli altaj tenaj temperaturoj.

Gen-specifaj enkondukoj (GSP) estas la plej bonaj specifaj enkondukoj por la inversa transskriba paŝo.GSP estas kontraŭsensa oligonukleozido kiu povas specife hibridigi kun RNA-celloksekvencoj, prefere ol kalumi ĉiujn Rnas kiel hazardaj enkondukoj aŭ oligo (dT).La reguloj uzitaj por dizajni PCR-enkondukojn ankaŭ validas por la dezajno de inversa transskriba reago GSP.GSP povas esti la sama sekvenco kiel la plifortiga enkonduko kalzita ĉe la fino de mRNA3′, aŭ GSP povas esti dizajnita por esti kalzita laŭflue kun la inversa plifortiga enkonduko.Por kelkaj plifortigitaj objektoj, estas necese dizajni pli ol unu kontraŭsensan enkondukon por sukcesa RT-PCR ĉar la sekundara strukturo de la cela RNA povas malhelpi la enkondukon ligado.Oni sugestas uzi 1pmol kontraŭsensan GSP en la unua ĉensinteza reakcia sistemo de 20μl.

2. Pliigu la varmecan konservan temperaturon de inversa transskribo:

Por plene utiligi GSP-specifecon, inversa transskribazo kun alta termika stabileco devus esti uzita.Varmstabila inversa transkriptazo povas esti izolita ĉe pli altaj temperaturoj por pliigi reagrigoron.Ekzemple, se GSP estas kalzita je 55 °C, tiam la specifeco de GSP ne estas plene utiligita se inversa transskribo estas farita je 37 °C kun malalta rigoro uzante AMV aŭ M-MLV.Tamen, SuperScripⅡ kaj ThermoScript povas reagi je 50℃ aŭ pli, kio forigas nespecifajn produktojn produktitajn ĉe pli malaltaj temperaturoj.Por maksimuma specifeco, la RNA/primermiksaĵo povas esti transdonita rekte de la 65℃ denatura temperaturo al la inversa transskribo tenanta temperaturon kun aldono de antaŭvarmigita 2 x reagmiksaĵo (termika iniciato de cDNA-sintezo).Ĉi tio helpas malhelpi bazpariĝon inter molekuloj ĉe malaltaj temperaturoj.Uzi PCR-instrumenton simpligas la multajn temperaturtransirojn necesajn por RT-PCR.

3. Redukti genoman DNA-poluadon:

Unu ebla malfacileco kun RT-PCR estas ke RNA poluas genoman DNA.La uzo de pli bonaj RNA-apartigaj metodoj, kiel ekzemple Trizol Reagent, reduktas genoman DNA-poluadon en RNA-preparoj.Por eviti produktojn produktitajn de genoma DNA, la RNA povas esti traktita kun plifortiga grado DnasⅠ por forigi poluitan DNA antaŭ inversa transskribo.La specimenoj estis konservitaj je 65℃ en 2.0mM EDTA dum 10 minutoj por ĉesigi DNaseⅠ-digestadon.EDTA kelatas magneziojonojn por malhelpi la magneziojon dependan RNA-hidrolizon kiu okazas ĉe altaj temperaturoj.

Por apartigi plifortigitan cDNA de la genoma DNA-plifortprodukto, enkondukoj kiuj kalmas aparte kun la separita eksono povas esti dizajnitaj.PCR-produktoj derivitaj de cDNA estos pli mallongaj ol tiuj derivitaj de poluita genoma DNA.Kontrolita eksperimento sen inversa transskribo ankaŭ estas farita sur ĉiu RNA-ŝablono por determini ĉu antaŭfiksita fragmento estas de genoma DNA aŭ cDNA.PCR-produktoj akiritaj en la foresto de inversa transskribo estas derivitaj de la genaro.

Rilata Produkto

RT-PCR Facila^ᵀᴹmi (Unu Paŝo)

-La unupaŝa ilaro ebligas inversan transskribon kaj PCR esti efektivigita en la sama tubo.Ĝi nur bezonas aldoni ŝablonon RNA, specifajn PCR-komencojn kaj RNase-Free ddH₂O.

-Realtempa kvanta analizo de RNA povas esti farita rapide kaj precize.

-La ilaro uzas unikan Foregene inversan transskriban reakciilon kaj Foregene HotStar Taq DNA Polymerase kombinitan kun unika reagsistemo por efike plibonigi la plifortigan efikecon kaj specifecon de la reago.

-La optimumigita reagsistemo igas la reakcion havi pli altan detektan sentivecon, pli fortan termikan stabilecon kaj pli bonan toleremon.

RT Easy II (Kun GDNase) Majstra Premiksaĵo Por Unufadena CDNA Sintezo Por Reala Tempo PCR Kun GDNase

-Efika kapablo forigi gDNA, kiu povas forigi gDNA en la ŝablono ene de 2 minutoj.

-Efika inversa transskriba sistemo, necesas nur 15 minutoj por kompletigi la sintezon de la unua fadeno cDNA.

-Kompleksaj ŝablonoj: ŝablonoj kun alta GC-enhavo kaj kompleksa malĉefa strukturo ankaŭ povas esti inversigitaj kun alta efikeco.

-Alt-sentema inversa transskriba sistemo, pg-nivelaj ŝablonoj ankaŭ povas akiri altkvalitan cDNA.

-La inversa transskriba sistemo havas altan termikan stabilecon, la optimuma reakcia temperaturo estas 42℃, kaj ĝi ankoraŭ havas bonan inversan transskriban rendimenton je 50℃.