RT-qPCR estas evoluigita el ordinara PCR-teknologio.Ĝi aldonas fluoreskajn kemiaĵojn (fluoreskaj tinkturfarboj aŭ fluoreskaj enketoj) al la tradicia PCR-reaga sistemo, kaj detektas la PCR-analiĝon kaj etendan procezon en reala tempo laŭ iliaj malsamaj lumineskaj mekanismoj.Fluoreskaj signalŝanĝoj en la medio estas uzataj por kalkuli la kvanton de produktoŝanĝo en ĉiu ciklo de PCR.Nuntempe, la plej oftaj metodoj estas fluoreska tinkturfarbo-metodo kaj enketmetodo.

Fluoreska tinkturfarba metodo:
Kelkaj fluoreskaj tinkturfarboj, kiel ekzemple SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO, ktp., ne elsendas lumon per si mem, sed elsendas fluoreskecon post ligado al la negrava kanelo de dsDNA.Tial, komence de la PCR-reago, la maŝino ne povas detekti la fluoreskan signalon.Kiam la reago daŭrigas al la annealing-etendiĝo (du-ŝtupa metodo) aŭ etendstadio (tri-ŝtupa metodo), la duoblaj fadenoj estas malfermitaj ĉe tiu tempo, kaj la nova DNA-polimerazo Dum fadensintezo, fluoreskaj molekuloj estas kombinitaj en la dsDNA negrava sulko kaj elsendas fluoreskecon.Ĉar la nombro da PCR-cikloj pliiĝas, pli kaj pli da tinkturfarboj kombinas kun dsDNA, kaj la fluoreska signalo ankaŭ estas ade plifortigita.Prenu SYBR Green Ⅰ kiel ekzemplon.
Sonda metodo:
Taqman-enketo estas la plej ofte uzita hidrolizsondilo.Estas fluoreska grupo ĉe la 5′ fino de la enketo, kutime FAM.La enketo mem estas sekvenco komplementa al la celgeno.Ekzistas fluoreska estinga grupo ĉe la 3′ fino de la fluoroforo.Laŭ la principo de fluoreskeca resonanca energio translokigo (Förster resonanca energio translokigo, FRET), kiam la raportisto fluoreska grupo (donacanto fluoreska molekulo) kaj la estinga fluoreska grupo (akceptanto fluoreska molekulo) Kiam la ekscita spektro interkovras kaj la distanco estas tre proksima (7-10nm), la ekscito de la donacanto povas indukti la fluoreska molekulo, dum la fluoreska molekulo akceptas la fluoreskanta molekulo. estas malfortigita.Tial, komence de la PCR-reago, kiam la sondilo estas libera kaj nerompita en la sistemo, la raportisto fluoreska grupo ne elsendos fluoreskecon.Dum kalciado, la enkonduko kaj sondilo ligas al la ŝablono.Dum la etendstadio, la polimerazo ade sintezas novajn ĉenojn.DNA-polimerazo havas 5′-3′ eksonukleazaktivecon.Alveninte la enketon, la DNA-polimerazo hidrolizas la enketon de la ŝablono, apartigos la raportan fluoreskan grupon de la estingilo-fluoreska grupo kaj liberigos la fluoreskan signalon.Ĉar ekzistas unu-al-unu rilato inter la enketo kaj la ŝablono, la enketmetodo estas pli bona ol la tinkturfarba metodo laŭ la precizeco kaj sentemo de la testo.

Figo 1 Principo de qRT-PCR

Unua dezajno
Principoj:

La enkondukoj devus esti dizajnitaj en la konservita regiono de la nuklea acida serio kaj havi specifecon.

Plej bone estas uzi cDNA-sekvencon, kaj mRNA-sekvenco ankaŭ estas akceptebla.Se ne, malkovru la cds-regiondezajnon de la DNA-sekvenco.
La longeco de la fluoreska kvanta produkto estas 80-150bp, la plej longa estas 300bp, la amorlongo ĝenerale estas inter 17-25 bazoj, kaj la diferenco inter la kontraŭfluaj kaj laŭfluaj enkondukoj ne estu tro granda.

La enhavo de G+C estas inter 40% kaj 60%, kaj 45-55% estas la plej bona.
La TM-valoro estas inter 58-62 gradoj.
Provu eviti enkondukajn dimerojn kaj mem-dimerojn, (ne aperu pli ol 4 parojn da sinsekvaj komplementaj bazoj) harpingla strukturo, se neevitebla, faru ΔG<4.5kJ/mol* Se vi ne povas certigi, ke gDNA estis forigita dum inversa transskribo Pura, plej bone estas desegni la enkondukojn de la introno *3′ fino por eviti regionon, daŭran, T/C kaj riĉan strukturon ne povas esti modifita, A-2, T/C. 3) enkondukoj kaj ne-
specifa La homologio de la heterogene plifortigita sekvenco estas prefere malpli ol 70% aŭ havas 8 komplementan bazhomologion.
Datumbazo:
CottonFGD serĉo per ŝlosilvortoj
Unua dezajno:
IDT-qPCR enkonduka dezajno

Fig2 IDT interreta enkonduka ilo-paĝo

Fig3 rezulto paĝo ekrano
Dezajno de lncRNA-enkondukoj:
lncRNA:la samaj paŝoj kiel mRNA.
miRNA:La principo de la tigo-bukla metodo: Ĉar ĉiuj miRNA'oj estas mallongaj sekvencoj de proksimume 23 nt, rekta PCR-detekto ne povas esti farita, tiel ke la tigo-bukla sekvenco-ilo estas uzita.La tigo-bukla sekvenco estas unu-fadena DNA de proksimume 50 nt, kiu povas formi harpinglostrukturon memstare.3 'La fino povas esti desegnita kiel sekvenco komplementa al la miRNA parta fragmento, tiam la cela miRNA povas esti konektita al la tigo-buklosekvenco dum inversa transskribo, kaj la totala longo povas atingi 70bp, kiu estas en linio kun la longo de la plifortigita produkto determinita de qPCR.Tailing miRNA-komenca dezajno.
Plifortiga-specifa detekto:
Reta eksploddatumbazo: CottonFGD-eksplodo per sekvencsimileco
Loka eksplodo: Raportu uzi Blast+ por fari lokan eksplodon, linux kaj macos povas rekte establi lokan datumbazon, win10-sistemo ankaŭ povas esti farita post instalo de ubuntu bash.Krei lokan eksplodan datumbazon kaj lokan eksplodon;malfermu ubuntu bash sur win10.
Rimarko: Altlanda kotono kaj marinsula kotono estas tetraploidaj kultivaĵoj, do la rezulto de eksplodo ofte estos du aŭ pli da matĉoj.En la pasinteco, uzi NAU-kd-ojn kiel datumbazon por elfari eksplodon verŝajne trovos du homologajn genojn kun nur kelkaj SNP-diferencoj.Kutime, la du homologaj genoj ne povas esti apartigitaj per enbordezajno, tiel ke ili estas traktitaj kiel la samaj.Se estas evidenta indel, la enkonduko estas kutime desegnita sur la indel, sed tio povas konduki al la sekundara strukturo de la enkonduko La libera energio iĝas pli alta, kondukante al malkresko de plifortiga efikeco, sed tio estas neevitebla.

Detekto de komenca sekundara strukturo:
Paŝoj:malfermu oligo 7 → enigi ŝablonsekvencon → fermu subfenestron → konservi → lokalizi enkondukon sur ŝablono, premu ctrl+D por agordi enkondukan longon → analizi diversajn sekundarajn strukturojn, kiel ekzemple mem-dimeriga korpo, heterodimero, harpinglo, miskongruo, ktp. La lastaj du bildoj en Figuro 4 estas la testrezultoj de la enkondukoj.La rezulto de la antaŭa enkonduko estas bona, ekzistas neniu evidenta dimero kaj harpingla strukturo, neniuj kontinuaj komplementaj bazoj, kaj la absoluta valoro de libera energio estas malpli ol 4,5, dum la malantaŭa enkonduko montras kontinuan La 6 bazoj estas komplementaj, kaj la libera energio estas 8,8;krome aperas pli serioza dimero ĉe la 3′ fino, kaj aperas dimero de 4 sinsekvaj bazoj.Kvankam la libera energio ne estas alta, la 3′ dimero Chl povas grave influi plifortigan specifecon kaj plifortigan efikecon.Krome, necesas kontroli harpinglojn, heterodimerojn kaj miskongruojn.

Fig3 oligo7 detekto rezultoj
Detekto de plifortiga efikeco:
La plifortiga efikeco de la PCR-reago grave influas la PCR-rezultojn.Ankaŭ en qRT-PCR, la plifortiga efikeco estas precipe grava por la kvantaj rezultoj.Forigu aliajn substancojn, maŝinojn kaj protokolojn en la reakcia bufro.La kvalito de la enkondukoj ankaŭ havas grandan influon sur la plifortiga efikeco de qRT-PCR.Por certigi la precizecon de la rezultoj, kaj la relativa fluoreskeca kvantigo kaj la absoluta fluoreskeca kvantigo bezonas detekti la plifortigan efikecon de la enkondukoj.Estas rekonite, ke La efika qRT-PCR-amplifiga efikeco estas inter 85% kaj 115%.Estas du metodoj:
1. Norma kurba metodo:
a.Miksi cDNA
b.Gradienta diluo
c.qPCR
d.Lineara regresa ekvacio por kalkuli la plifortigan efikecon
2. LinRegPCR
LinRegPCR estas programo por la analizo de realtempaj RT-PCR-Datumoj, ankaŭ nomitaj kvantaj PCR (qPCR) datenoj bazitaj sur SYBR Green aŭ simila kemio.La programo uzas ne-bazliniajn korektitajn datenojn, elfaras bazlinian korekton sur ĉiu specimeno Aparte, determinas fenestro-de-linearecon kaj tiam uzas linearan regresan analizon por konveni rektan linion tra la PCR-datumaro.De la deklivo de ĉi tiu linio la PCR-efikeco de ĉiu individua provaĵo estas kalkulita.La averaĝa PCR-efikeco per amplikono kaj la Ct-valoro per provaĵo kutimas kalkuli komencan koncentriĝon per provaĵo, esprimita en arbitraj fluoreskecunuoj.Enigo kaj eligo de datumoj estas per Excel-kalkultabelo.Nur specimeno
miksado estas postulata, neniu gradiento
paŝoj estas bezonataj:(Prenu Bole CFX96 kiel ekzemplon, ne tute Maŝinon kun klara ABI)
eksperimento:ĝi estas norma qPCR-eksperimento.
Eligo de datumoj de qPCR:LinRegPCR povas rekoni du formojn de produktaĵdosieroj: RDML aŭ kvantigo Plifortiga rezulto.Fakte, ĝi estas la realtempa detekta valoro de la ciklonombro kaj fluoreskeca signalo de la maŝino, kaj la plifortigo estas akirita per analizado de la fluoreskeca ŝanĝovaloro de la lineara segmenta efikeco.
Elekto de datumoj: En teorio, la RDML-valoro devus esti uzebla.Oni taksas, ke la problemo de mia komputilo estas, ke la programaro ne povas rekoni RDML, do mi havas la excel-eligvaloron kiel la originalajn datumojn.Oni rekomendas unue fari malglatan kribradon de la datumoj, kiel la malsukceso de aldoni specimenojn, ktp. La punktoj povas esti forigitaj en la eligo-datumoj (kompreneble, vi ne povas forigi ilin, LinRegPCR ignoros ĉi tiujn punktojn en la posta etapo)

Fig5 qPCR-datumeksporto

Fig6 elekto de kandidatoj specimenoj

Enigo de datumoj:Malfermu kvalifikan plifortigan rezultojn.xls, → malfermu LinRegPCR → dosieron → legi el excel → elektu parametrojn kiel montrite en Figuro 7 → OK → klaku determini bazliniojn

Fig7-paŝoj de linRegPCR-datenigo

Rezulto:Se ne estas ripeto, ne necesas grupigo.Se estas ripeto, la grupiĝo povas esti redaktita en la specimena grupigo, kaj la nomo de la geno estas enigita en la identigilon, kaj tiam la sama geno estos aŭtomate grupigita.Fine, alklaku la dosieron, eksportu excel, kaj vidu la rezultojn.La plifortiga efikeco kaj R2-rezultoj de ĉiu puto estos montrataj.Due, se vi dividas en grupojn, la korektita averaĝa plifortiga efikeco estos montrata.Certigu, ke la plifortiga efikeco de ĉiu enkonduko estas inter 85% kaj 115%.Se ĝi estas tro granda aŭ tro malgranda, tio signifas, ke la plifortiga efikeco de la enkonduko estas malbona.

Fig. 8 Rezulto kaj eligo de datumoj

Eksperimenta procezo:
Postuloj pri RNA-kvalito:
Pureco:1.72.0 indikas ke povas ekzisti resta izotiocianato.Pura nuklea acido A260/A230 devus esti ĉirkaŭ 2 .Se estas forta sorbado ĉe 230 nm, ĝi indikas, ke ekzistas organikaj komponaĵoj kiel fenataj jonoj.Krome, ĝi povas esti detektita per elektroforezo de 1.5% agaroza ĝelo.Montru la signon, ĉar la ssRNA havas neniun denaturon kaj la molekula pezo-logaritmo ne havas linearan rilaton, kaj la molekula pezo ne povas esti ĝuste esprimita.Koncentriĝo: Teorienemalpli ol 100ng/ul, se la koncentriĝo estas tro malalta, la pureco estas ĝenerale malalta ne alta

Fig9 RNA-ĝelo

Krome, se la specimeno estas altvalora kaj la RNA-koncentriĝo estas alta, oni rekomendas allikvoti ĝin post eltiro, kaj dilui la RNA al fina koncentriĝo de 100-300ng/ul por inversa transskribo.Enla procezo de inversa transskribo, kiam mRNA estas transskribita, oligo (dt) enkondukoj kiuj povas specife ligi al polyA-vostoj estas uzitaj por inversa transskribo, dum lncRNA kaj circRNA uzas hazardajn heksamer (Hazarda 6 mer) enkondukojn por inversa transskribo de totala RNA Por miRNA, miRNA-specifaj kol-buklaj enkondukoj estas uzitaj por inversa transskribo.Multaj firmaoj nun lanĉis specialajn postsekaĵojn.Por la tigo-buklo-metodo, la vosta metodo estas pli oportuna, alt-produkta kaj reakci-ŝpara, sed La efiko de distingi miRNA-ojn de la sama familio ne devus esti tiel bona kiel la tigo-buklo-metodo.Ĉiu inversa transskriba ilaro havas postulojn por la koncentriĝo de gen-specifaj enkondukoj ( tigo-bukloj).La interna referenco uzita por miRNA estas U6.En la procezo de tigo-buklo inversio, tubo de U6 devus esti inversigita aparte, kaj la antaŭaj kaj malantaŭaj enkondukoj de U6 devus esti aldonitaj rekte.Kaj circRNA kaj lncRNA povas uzi HKGojn kiel internan referencon.EncDNA-detekto,
se ne estas problemo kun RNA, cDNA ankaŭ devus esti bona.Tamen, se la perfekteco de la eksperimento estas traktita, estas plej bone uzi internan referencan genon (Referenca geno, RG) kiu povas distingi gDNA de KD.Ĝenerale, RG estas mastruma geno., HKG) kiel montrite en Figuro 10;En tiu tempo, mi faris sojfaban stokproteinon, kaj uzis actin7 enhavantan intronojn kiel internan referencon.La grandeco de la plifortigita fragmento de tiu enkonduko en gDNA estis 452bp, kaj se cDNA estis utiligita kiel ŝablono, ĝi estis 142bp.Tiam la testrezultoj trovis, ke Parto de la cDNA estis fakte poluita de gDNA, kaj ĝi ankaŭ pruvis, ke ne estis problemo kun la rezulto de inversa transskribo, kaj ĝi povus esti uzata kiel ŝablono por PCR.Estas senutile ruli agarozan ĝelan elektroforezon rekte kun cDNA, kaj ĝi estas difuza bando, kio ne konvinkas.

Figo 10 cDNA-detekto

La persistemo de qPCR-kondiĉojestas ĝenerale neniu problemo laŭ la protokolo de la ilaro, ĉefe en la paŝo de tm valoro.Se kelkaj enkondukoj ne estas bone desegnitaj dum enkonduko-dezajno, rezultigante grandan diferencon inter la tm-valoro kaj la teoria 60 °C, estas rekomendite ke la cDNA Post kiam la specimenoj estas miksitaj, rulu gradientan PCR kun enkondukoj, kaj provu eviti agordi la temperaturon sen bendoj kiel la TM-valoro.

Analizo de datumoj

La konvencia relativa fluoreskeca kvanta PCR-pretigmetodo estas baze laŭ 2-ΔΔCT.Ŝablono pri datumtraktado.

Rilataj Produktoj:

Reala Tempo PCR Facila^TM –Taqman

Reala Tempo PCR Facila^TM –SYBR VERDA I

RT Easy I (Mastra Premiksaĵo por unua fadena cDNA-sintezo)

RT Easy II (Mastra Premiksaĵo por unua fadena cDNA-sintezo por qPCR)