Ĉiuj parolas pri la principo de qRT-PCR-eksperimento, enkonduka dezajno, rezulta interpreto ktp., sed mi pensas, ke mi devus dividi kun vi la eksperimentan funkciadon de qRT-PCR.Ĝi estas malgranda, sed temas pri rezultoj.
Antaŭ ol fari qRT-PCR, ni devas havi klaran komprenon pri niaj propraj RNA kaj operaciaj metodoj.Post ĉio, niaj klopodoj celas akiri rezultojn, prefere ol simple ekzercado.Do antaŭ ol fari qRT-PCR, ni devas determini la sekvajn aferojn (kelkaj el kiuj nur aplikeblas al SYBR).
1 Ĉu vi certas, ke via RNA ne estas degradita?
NanoDrop 2000 povas nur detekti la koncentriĝon kaj purecon de RNA, sed ne povas detekti la integrecon de RNA.
La RNA (RNA Intesity Number) valoro povas reflekti la integrecon de la RNA, kiu estas detektita de la Agilent 2100 Bioanalyzer-sistemo.
Fig. Skema diagramo de RIN-valoroj por malsamaj RNA-provaĵoj (eŭkariotoj)
Tamen, laboratorioj ĝenerale ne havas Agilent 2100 Bioanalyzer.En ĉi tiu kazo, ni povas detekti per formaldehida ĝelo, sed la postulo por la totala kvanto de RNA estas alta, do la plej rapida metodo estas uzi ordinaran ĝelan elektroforezon.Ĝi devas esti en sennuklea medio, do necesas lavi la elektroforezan tankon, solbotelon, ĝelan krampon kaj kombi kun DEPC-akvo.La agarozo ankaŭ estas sennukleazo (kondiĉe kiel ĝi estas ĵus malfermita), kaj la Ŝarĝa Bufro devus esti ĵus malfermita kiel eble plej multe, kun 1.2% ĝelo.
Notu, ke la ĝelo devas esti tute solvita, alie ĝi kaŭzos nehomogenajn bendojn, kiel montrite en specimeno 9 en la figuro.Se la tensio estas tro alta aŭ kuranta tro longe generos varmon kaj kaŭzos RNA-degeneron, do la tensio kaj tempo estu prudente kontrolitaj.Krome, ĝelkurado ankaŭ povas plu determini ĉu ekzistas DNA-restaĵo en la provaĵo, kaj observi ĉu ekzistas granda nombro da retenitaj bandoj en la disdona puto.
Figuro.Detekto de ĝelelektroforezo de RNA
2 Ĉu vi certas pri la koncentriĝo de via cDNA?
La sperto de la grandaj fratoj en la laboratorio estas, ke la cDNA de la 20 ul-sistemo akirita per ĉiu inversio estas rekte diluita 20X, dum la postdoktoriĝaj fratinoj estas diluita 10X.Mi kutime dependas de la situacio.Ĉar la kvalito de la RNA menciita de ĉiu persono estas malsama, la nivelo de inversigo ankaŭ estas malsama, kaj la inversiga teknologio eble ne estas stabila.
Do ĉiufoje kiam mi ricevas la inversigitan cDNA, mi unue diluos ĝin ĉirkaŭ 3 fojojn, kaj poste uzos la mastruman genon por fari RT-PCR, la nombro da cikloj estas ĝenerale 25 cikloj, por identigi la specifan koncentriĝon, kaj poste determini la finan diluan faktoron.
3 Ĉu vi certas, ke viaj enkondukoj estas facile uzeblaj?
Ĝi povas pasi la fandan kurbon de qRT-PCR, sed ĉi tio ankoraŭ kostas monon.Por laboratorioj sen multe da mono, kiam ili ricevas multajn enkondukojn, ili povas uzi ordinaran RT-PCR por vidi ĉu ĝi estas ununura bando kaj identigi la specifecon de la enkondukoj.Se la laboratorio ne mankas je mono, la specifeco de ĉiuj enkondukoj povas esti identigita unufoje tra la degela kurbo.
4 Ĉu vi certas, ke viaj eksperimentaj kondiĉoj taŭgas?
SYBR devas esti protektita kontraŭ forta lumo, do provu malŝalti la superan lumon aldonante SYBR-reakciilon, kaj nur bezonas uzi malfortan lumon por kompletigi ĝin.
Konservu SYBR je 4 °C.Kiam estas uzata, milde renversu supren kaj malsupren por bone miksi por eviti ŝaŭmi, kaj ne vortigi vigle.
Iuj pli junaj fratinoj ŝatas desegni markojn sur la PCR-tabulo pro timo miksi la specimenojn, kio estas malĝusta.Ĉar viaj markiloj tre verŝajne influos la kolekton de fluoreskaj signaloj, mi ĝenerale rekomendas al junuloj uzi eksperimentajn kajerojn por helpi en memoro, kiel montrite sube.
Figuro.qRT-PCR specimena ŝarĝa diagramo
5 Ĉu vi certas, ke vi faras ĝin ĝuste?
Nepre portu gantojn, portu gantojn, portu gantojn kaj diru gravajn aferojn trifoje.
Por redukti la ekspozicion de SYBR al lumo, mi persone ŝatas unue aldoni ŝablonon, kiel montrite en la suba figuro.Laŭ sperto, aldono de malgranda kvanto da ŝablono verŝajne kaŭzos specimenajn erarojn.Tial, por minimumigi la eraron kaŭzitan de aldonado de malgranda kvanto de ŝablono, mi kutime duobligas la specimenon denove, kaj duobligas la kvanton aldonante la specimenon por redukti la kvanton de H2O2 aldonita.
Figuro.Skema diagramo de qRT-PCR-ŝarĝado
Tiam agordu la qRT-PCR-sistemon jene.
Figuro.qRT-PCR-sistema prepardiagramo
NOTO: La agorda procezo devas esti farita sur glacio.
Post aldoni la specimenon, algluu la travideblan sigelan filmon.Provu ne tuŝi la surfacon de la travidebla sigela filmo per viaj manoj, nur agu de la spaco ambaŭflanke de la filmo.Ĉar fingrospuroj ankaŭ povas influi la kolekton de fluoreskaj signaloj.Poste uzu centrifugilon por rapide centrifuĝi dum 10 s je malalta rapido por malhelpi la specimenon pendi sur la muro.
Rilataj Produktoj:
Afiŝtempo: Apr-28-2023
