PCR (polimeraza ĉena reago) estas unu el la en-vitro DNA-amplifigaj teknologioj, kun historio de pli ol 30 jaroj.

PCR-teknologio estis iniciatita fare de Kary Mullis de Cetus, Usono en 1983. Mullis petis pri PCR-patento en 1985 kaj publikigis la unuan PCR-akademian artikolon pri Science en la sama jaro.Al Mullis estis premiita la nobelpremio pri kemio en 1993 pro sia laboro.

Bazaj Principoj de PCR

PCR povas plifortigi celajn DNA-fragmentojn je pli ol unu miliono da fojoj.La principo estas sub la katalizo de DNA-polimerazo, uzante gepatran fadenon DNA kiel ŝablonon kaj specifan enkondukon kiel la deirpunkton por etendaĵo.Ĝi estas reproduktita en vitro tra ŝtupoj kiel ekzemple denaturigo, kalciado, kaj etendaĵo.La procezo de filinfadena DNA komplementa al la gepatra fadenŝablona DNA.

La norma PCR-procezo estas dividita en tri ŝtupojn:

1.Denaturado: Uzu altan temperaturon por apartigi DNA-duoblajn fadenojn.La hidrogena ligo inter DNA-duobla fadeno estas rompita ĉe alta temperaturo (93-98℃).

2.Annealing: Post kiam la duoble-fadena DNA estas apartigita, malaltigu la temperaturon por ke la enkonduko povas ligi al la unu-fadena DNA.

3.Etendaĵo: La DNA-polimerazo komencas sintezi komplementajn fadenojn laŭ la DNA-fadenoj de la enkondukoj ligitaj kiam la temperaturo estas malaltigita.Kiam la etendaĵo estas kompletigita, ciklo estas kompletigita, kaj la nombro da DNA-fragmentoj duobliĝas

Reciprocante ĉi tiujn tri paŝojn 25-35 fojojn, la nombro da DNA-fragmentoj pliiĝos eksponente.

La eltrovemo de PCR estas ke malsamaj enkondukoj povas esti dizajnitaj por malsamaj celgenoj, tiel ke celgenfragmentoj povas esti plifortigitaj en mallonga tempodaŭro.

Ĝis nun, PCR povas esti dividita en tri kategoriojn, nome ordinara PCR, fluoreska kvanta PCR kaj cifereca PCR.

La unua generacio de ordinara PCR

Uzu ordinaran PCR-amplifilon por plifortigi la celgenon, kaj poste uzu agarozan ĝelan elektroforezon por detekti la produkton, nur kvalita analizo povas esti farita.

La ĉefaj malavantaĝoj de la unua generacio PCR:

1.Inklina al nespecifa plifortigo kaj falsaj pozitivaj rezultoj.

2.La detekto prenas longan tempon kaj la operacio estas maloportuna.

3.Nur kvalita testo povas esti farita

Duageneracia Real-Tempo PCR

Real-Time PCR, ankaŭ konata kiel qPCR, uzas fluoreskajn sondilojn kiuj povas indiki la progreson de la reagsistemo, kaj monitoras la amasiĝon de plifortigitaj produktoj tra la amasiĝo de fluoreskecaj signaloj, kaj juĝas la rezultojn tra la fluoreska kurbo.Ĝi povas esti kvantigita helpe de Cq-valoro kaj norma kurbo.

Ĉar la qPCR-teknologio estas efektivigita en fermita sistemo, la probablo de poluado estas reduktita, kaj la fluoreskeca signalo povas esti monitorita por kvanta detekto, do ĝi estas la plej vaste uzata en klinika praktiko kaj fariĝis la domina teknologio en PCR.

La fluoreskaj substancoj uzitaj en realtempa fluoreska kvanta PCR povas esti dividitaj en: TaqMan-fluoreska sondilo, molekulaj signostangoj kaj fluoreska tinkturo.

1) fluoreska sondilo TaqMan:

Dum PCR-plifortigo, specifa fluoreska enketo estas aldonita aldonante paron de enkonduko.La enketo estas oligonukleotido, kaj ambaŭ finoj estas etikeditaj kun raportisto-fluoreska grupo kaj estingilo-fluoreska grupo.

Kiam la sondilo estas sendifekta, la fluoreska signalo elsendita de la raportistogrupo estas sorbita de la estinga grupo;dum PCR-amplificado, la 5′-3′ eksonukleaza agado de Taq-enzimo fendas kaj degradas la enketon, igante la raportiston fluoreskan grupon kaj estingilon La fluoreska grupo estas apartigita, tiel ke la fluoreskeca monitora sistemo povas ricevi la fluoreskecan signalon, tio estas, ĉiufoje kiam DNA-fadeno estas plifortigita, la fluoreskeca signalo estas tute sinkronigita, la fluoreska formado estas tute sinkronigita kun fluoreskeco. la PCR-produkto.

2) SYBR fluoreska tinkturfarbo:

En la PCR-reagsistemo, troo de SYBR-fluoreska tinkturfarbo estas aldonita.Post kiam la SYBR-fluoreska tinkturfarbo estas nespecife integrigita en la DNA-du-fadeno, ĝi elsendas fluoreskan signalon.La SYBR-tinkturfarba molekulo, kiu ne estas korpigita en la ĉenon, ne elsendos ajnan fluoreska signalo, tiel certigante la fluoreska signalo. La pliiĝo de PCR-produktoj estas tute sinkronigita kun la pliiĝo de PCR-produktoj.SYBR nur ligas al duoble-senhelpa DNA, tiel ke la degela kurbo povas esti uzita por determini ĉu la PCR-reago estas specifa.

3) Molekula signostango:

Ĝi estas tigo-buklo duoble-etikedita oligonukleotid-enketo kiu formas harpinglan strukturon de proksimume 8 bazoj ĉe la 5 kaj 3 finoj.La nukleaacidosekvencoj ĉe ambaŭ finoj estas komplemente parigitaj, igante la fluoreskan grupon kaj la estingan grupon esti mallozaj.Proksime, neniu fluoreskeco estos produktita.

Post kiam la PCR-produkto estas generita, dum la kalcia procezo, la meza parto de la molekula signostango estas parigita kun specifa DNA-sekvenco, kaj la fluoreska geno estas apartigita de la estingiga geno por produkti fluoreskecon.

La ĉefaj malavantaĝoj de duageneracia PCR:

Sentemo ankoraŭ mankas, kaj la detekto de malaltkopiaj specimenoj estas malpreciza.

Estas la influo de la fona valoro, kaj la rezulto estas susceptible al interfero.

Kiam ekzistas PCR-inhibitoroj en la reagsistemo, la detektrezultoj estas sentemaj al interfero.

Tria generacio cifereca PCR

Cifereca PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) kalkulas la kopinumeron de la celsekvenco per finpunkta detekto, kaj povas elfari precizan absolutan kvantan detekton sen uzado de internaj kontroloj kaj normaj kurboj.

Cifereca PCR uzas finpunktan detekton kaj ne dependas de la Ct-valoro (cikla sojlo), do la cifereca PCR-reago estas malpli tuŝita de la plifortiga efikeco, kaj la toleremo al PCR-reakinhibitoroj estas plibonigita, kun alta precizeco kaj reproduktebleco.

Pro la karakterizaĵoj de alta sentemo kaj alta precizeco, ĝi ne estas facile interrompita de PCR-reagaj inhibitoroj, kaj ĝi povas atingi veran absolutan kvantigon sen normaj produktoj, kiu fariĝis esplora kaj aplikaĵa punkto.

Laŭ la malsamaj formoj de la reaktunuo, ĝi povas esti dividita en tri ĉefajn tipojn: mikrofluidaj, pecetaj kaj gutetaj sistemoj.

1) Mikrofluida cifereca PCR, mdPCR:

Surbaze de la mikrofluida teknologio, la DNA-ŝablono estas apartigita.La mikrofluida teknologio povas realigi la specimenan nano-ĝisdatigon aŭ la generacion de pli malgrandaj gutetoj, sed la gutetoj bezonas specialan adsorbadmetodon kaj poste kombinitaj kun la PCR-reaga sistemo.mdPCR estis iom post iom adoptita per aliaj metodoj anstataŭas.

2) Cifereca PCR bazita en gutetoj, ddPCR:

Uzu akvo-en-olea guteto-generado-teknologion por prilabori la specimenon en gutetojn, kaj dividu la reagsistemon enhavantan nukleajn acidajn molekulojn en milojn da nanoskalaj gutetoj, ĉiu el kiuj ne enhavas la nuklean acidan celmolekulon por esti detektita, aŭ Enhavas unu al pluraj nukleacidaj celmolekuloj por esti testita.

3) Ĉip-bazita cifereca PCR, cdPCR:

Uzu la integran fluidan vojon-teknologion por gravuri multajn mikrotubojn kaj mikrokavaĵojn sur siliciaj oblatoj aŭ kvarcvitro, kaj kontroli la fluon de la solvo per malsamaj kontrolvalvoj, kaj dividu la specimenan likvaĵon en nanometrojn de la sama grandeco en la reagputojn por cifereca PCR-Reago por atingi absolutan kvantigon.

La ĉefaj malavantaĝoj de la tria generacio PCR:

La ekipaĵo kaj reakciiloj estas multekostaj.

La ŝablonaj kvalitpostuloj estas altaj.Se la ŝablonkvanto superas la mikrosistemkvanton, estos neeble kvantigi, kaj se ĝi estas tro malgranda, la kvantiga precizeco estos reduktita.

Falsaj pozitivoj ankaŭ povas esti generitaj kiam ekzistas nespecifa plifortigo.