PCR, multoblaj PCR, Surloka PCR, Inversa PCR, RT-PCR, qPCR（1）–PCR
Ni ordigos la konceptojn, paŝojn kaj detalojn de diversaj PCR
Ⅰ. PCR
Polymerase Chain Reaction, referita kiel PCR, estas molekula biologia teknologio kiu kutimas pligrandigi specifajn DNA-fragmentojn.Ĝi povas esti rigardita kiel speciala DNA-reproduktado en vitro.DNA-polimerazo (DNA Polymerase I) estis malkovrita jam en 1955, kaj Klenow Fragmento de E. Coli, kiu havas eksperimentan valoron kaj praktikecon, estis malkovrita de D-ro H. Klenow en la fruaj 1970-aj jaroj, sed ĉar tiu enzimo ne toleras temperaturon, alta temperaturo povas degeneri ĝin, do ĝi ne renkontas la reago de alta temperaturo degenero de polimerazo.La enzimoj uzataj hodiaŭ (nomitaj Taq-polimerazo), estis izolitaj de Thermus aquaticus , varmfonta bakterio en 1976. Ĝia karakterizaĵo estas ke ĝi povas rezisti altan temperaturon kaj estas ideala enzimo, sed ĝi estas vaste uzata post la 1980-aj jaroj.La origina koncepto de la origina primitiva prototipo de PCR similas al gena riparo kaj kopiado, kiu estis proponita de D-ro KJell Kleppe en 1971. Li publikigis la unuan simplan kaj mallongdaŭran genkopion (simila al la unuaj du cikloreagoj de PCR).La PCR disvolvita hodiaŭ estis evoluigita de D-ro Kary B. Mullis en 1983. D-ro Mullis servis PE-kompaniojn tiun jaron, do PE havas specialan statuson en la PCR-industrio.D-ro Mullis oficiale publikigis la unuan rilatan artikolon kun Saiki kaj aliaj en 1985. Ekde tiam, la uzo de PCR estas miloj da mejloj tage, kaj la kvalito de rilataj artikoloj povas esti diri, ke multaj aliaj esplormetodoj malbongustas.Poste, PCR-teknologio estas vaste uzata en biologia scienca esplorado kaj klinikaj aplikoj, iĝante la plej grava teknologio de molekula biologia esplorado.Mullis ankaŭ gajnis la 1993-datita nobelpremion en Kemio.
PCRPrincipo
La baza principo de PCR-teknologio estas simila al la natura reproduktadprocezo de DNA, kaj ĝia specifeco dependas de la oligonucleotid enkonduko kiu estas komplementa al ambaŭ finoj de la celsekvenco.PCR konsistas el degenero-rekuado-etendiĝanta tri bazaj reagoj paŝoj: ①Degenero de ŝablono DNA: Post kiam la ŝablono DNA estas varmigita al ĉirkaŭ 93 °C dum certa tempodaŭro, la duobla DNA solvo por la duobla ĉeno DNA formita de la PCR plifortigo de la ŝablono DNA Elirante, fari ĝin ununura ĉeno povas esti kombinita kun la enkonduko reago povas esti kombinita por la sekva reago.②La kalciado (kunmetaĵo) de la ŝablono DNA kaj la enkonduko: Post kiam la ŝablono DNA estas varmigita kaj degenerita en ununuran ĉenon, la temperaturo falas al ĉirkaŭ 55 °C.La komplementa sekvenco de la enkonduko kaj la ŝablono DNA-unuĉena.③La etendo de la enkonduko: DNA-ŝablono - la enkonduka ligado baziĝas sur la ago de TaqDNA polimerazo, kun dNTP kiel la reakcia krudaĵo.Konservu la principon de reproduktado, sintezu novan duonrezervitan kopiĉenon, kiu kompletigas la ŝablonon DNA-ĉenon, kaj ripetu ciklon degenero-rekuado-etendo tri procezoj povas akiri pli da "duonrezervita kopiĉeno", kaj ĉi tiu nova ĉeno disponeblas denove Iĝu ŝablono por la sekva ciklo.Ĝi bezonas 2-4min por kompletigi la buklon, la cela geno povas esti plifortigita plurajn milionojn da fojoj en 2-3 horoj.
NormoPCRReagsistemo
| Taq DNA-polimerazo | 2,5 μl |
| Mg2+ | 1,5 mmol/L |
| 10× plifortiga bufro | 10μl |
| 4 dNTP miksaĵoj | 200μl |
| Ŝablono DNA | 0,1~2μg |
| Primer | 10~100μl |
| Aldonu duoblan aŭ trioblan vaporantan akvon | 100 μl |
Kvin elementoj de PCR-reago
Estas ĉefe kvin specoj de substancoj implikitaj en PCR-reago, nome enkonduko, enzimo, dNTP, ŝablono kaj bufro (Mg2+ estas postulata).[PCR-proceduro]
La norma PCR-procezo estas dividita en tri ŝtupojn
1. DNA-degenero (90°C-96°C): DNA-ŝablonoj de duobla ĉeno sub termika ago, hidrogenaj ligoj rompiĝas, formante unuĉenan DNA.
2. Kolektado (25℃ -65℃): La sistemo temperaturo estas reduktita, la enkonduko estas kombinita kun la DNA-ŝablono por formi lokan duoblan ĉenon.
3. Etendo (70℃ -75℃): Sub la ago de Taq-enzimo (ĉirkaŭ 72°C, la plej bona aktiveco), dNTP estas uzata kiel la kruda materialo, etendiĝas de la 5′ fino de la enkonduko → 3′ fino, sintezo kaj ŝablono kompletigas unu la alian DNA-ĉeno.
Ĉiu ciklo estas denaturita, kalzita kaj etendita, duobligante la DNA-enhavon.Nuntempe, pro la mallonga plifortiga areo, iu PCR povas esti reproduktita en tre mallonga tempo eĉ se la Taq-enzima aktiveco ne estas optimuma, do ĝi povas esti ŝanĝita al du paŝoj, tio estas, la kalciado kaj etendaĵo povas esti faritaj je 60 °C-65 °C samtempe.Por redukti la procezon de levado kaj malvarmigo kaj plibonigi la respondrapidecon.
Ecoj de PCR Reaction
● Alta Specifeco
La specifaj decidaj faktoroj de la PCR-respondo estas: ①La specifa kombinaĵo de la enkonduko kaj la ŝablono DNA.②La principo de baza parigo.③La lojaleco de la TaqDNA-polimeraza sinteza reago.④La specifeco kaj konservativeco de la cela geno.
La ĝusta kombinaĵo de enkondukoj kaj ŝablonoj estas la ŝlosilo.La ligado de la enkonduko kaj la ŝablono kaj la etendaĵo de la enkonduka ĉeno baziĝas sur la principo de alkala bazkongruo.La lojaleco de polimerazaj sintezaj reagoj kaj la alta temperaturrezisto de la Taq DNA-polimerazo por fari la ligadon (kunmetaĵon) de la ŝablono kaj enkonduko en la reago povas esti farita ĉe pli alta temperaturo.La specifeco de la kombinaĵo estas multe pliigita.La klipo povas konservi altan gradon de ĝusteco.Elektante celan genetikan regionon kun alta konservativeco kaj alta konservativeco, ĝia specifeco estas pli alta.
● Alta Sentemo
La produktadvolumo de PCR-produktoj estas pliigita per indekso, kiu povas vastigi la komencan ŝablonon de Picker (PG=10-12) por pliigi la nivelon de mikroregilo al la nivelo de mikrogramoj (μg= -6).Celĉeloj povas esti detektitaj de 1 miliono da ĉeloj;en la detekto de virusoj, la sentemo de PCR povas atingi 3 RFU-ojn (malplenaj makuloj formitaj unuoj);la minimuma detekta indico en bakteria scienco estas 3 bakterioj.
● Simpla kaj Rapida
La PCR-reflektado uzas alt-temperaturan Taq DNA-polimerazon, kiu aldonas la reakcian solvon samtempe, tio estas, degenero-aneal-etendan reagon sur la DNA-amplifiga solvo kaj akvobanan poton.Ĝenerale, la plifortiga reago finiĝas en 2 ĝis 4 horoj.Pliigitaj produktoj estas ĝenerale analizitaj per elektra glavo, kaj ne devas uzi izotopojn, neniun radioaktivan poluon kaj facilan reklamadon.
● La pureco de la specimeno estas malalta
Ne necesas apartigi virusojn aŭ bakteriojn kaj kulturĉelojn.DNA-krudaj produktoj kaj RNA povas esti uzataj kiel amplifiloj.DNA-plifortiga detekto povas esti uzata rekte uzante klinikajn specimenojn kiel sango, korpa likvaĵo, tusa lavlikvaĵo, hararo, ĉeloj kaj vivanta histo.
PCRkomunaj problemoj
● Falsa negativo, sen plifortigitaj bandoj
La ŝlosilaj etapoj de la PCR-reago inkluzivas: ① preparado de ŝablonaj nukleaj acidoj, ② kvalito kaj specifeco de enkondukoj, ③ la kvalito de enzimoj ④ PCR-ciklokondiĉoj.Trovi la kialon ankaŭ estu analizita kaj studita por la supraj ligiloj.
Ŝablonoj: ① La ŝablono enhavas diversajn proteinojn, ② La ŝablono enhavas Taq-enziminhibitoron, ③ La proteino en la ŝablono ne estas forigita, precipe la grupproteino en la kromosomo.⑤ Deminer nuklea acida degenero ne estas ĝisfunda.Kiam la kvalito de enzimoj kaj enkondukoj estas bona, ne ekzistas plifortiga bando, kiu plej verŝajne estas la digesta traktado de specimenoj.Estas io malĝuste kun la ŝablono eltira procezo de nuklea acido, do por prepari efikan kaj stabilan digestan solvon, ĝia proceduro estu fiksita kaj ne arbitre ŝanĝita.
Enzimmalaktivigo: nova enzimo aŭ kaj malnovaj kaj novaj enzimoj devus esti uzitaj kune por analizi ĉu la enzimaktiveco estas perdita aŭ nesufiĉa, kondukante al malveraj negativoj.Oni devas rimarki, ke Taq-enzimo aŭ etidiobromido foje estas forgesitaj.
Enkonduko: la kvalito de la enkonduko, la koncentriĝo de la enkonduko, kaj ĉu la koncentriĝo de la du enkondukoj estas simetria.Ĝi estas ofta kialo de la PCR-fiasko aŭ la kreskanta bando ne estas ideala kaj inklina al difuzo.Estas problemoj kun la kvalito de la enkondukoj de iuj loknombroj.La du enkondukoj havas altan koncentriĝon kaj malaltan koncentriĝon, kaŭzante malalt-efikecan malsimetrian plifortigon.La kontraŭrimedoj estas: ① Elektu bonan enkondukon por sintezi unuojn.② La koncentriĝo de la enkonduko ne nur dependas de la OD-valoro, sed ankaŭ atentas la originan likvaĵon de la enkonduko por fari elektroforezon de agar-sukeroĝelo.Devas ekzisti primer-striozono, kaj la brileco de la du enkondukoj devus esti ĝenerale konsekvenca.Belt, PCR povas malsukcesi ĉi-momente, kaj ĝi devus esti solvita kun la unua sinteza unuo.Se enkonduko estas alta, la brileco estas malalta, kaj ĝia koncentriĝo devas esti ekvilibrigita kiam diluita.③ La enkonduko devas esti pagita kaj stokita en alta koncentriĝo por malhelpi multoblajn frostajn aŭ longdaŭrajn fridigajn partojn de la fridujo, kio kaŭzos la enkondukon difekti kaj degradi.④ La dezajno de la enkonduko estas neracia, kiel la longo de la enkonduko estas nesufiĉa, kaj la di-grupo estas formita inter la enkondukoj.
Mg2+koncentriĝo: Mg2+jonkoncentriĝo havas grandan efikon al PCR-amplifiga efikeco.Troa koncentriĝo povas redukti la kontraŭan sekson de PCR-plifortigo.Se la koncentriĝo estas tro malalta, la PCR-amplifiga eligo eĉ faros la PCR-plifortigan malsukceson sen la ekspansia bando.
Ŝanĝo de reakcia volumo: La volumo uzata en PCR-amplifilo estas 20ul, 30ul, kaj 50ul aŭ 100ul, la granda volumo de la aplikaĵo por PCR-amplificado estas agordita laŭ malsamaj celoj de scienca esplorado kaj klinika testado.Post fari malgrandajn volumojn kiel 20ul, necesas fari ŝnuron kondiĉon kiam oni faras la grandecon, alie ĝi malsukcesos.
Fizikaj kialoj: Transformo estas tre grava por PCR-plifortigo.Se la degenera temperaturo estas malalta, la degenera tempo estas mallonga, ĝi verŝajne okazos en falsaj negativoj;tro malalta kalcia temperaturo povas kaŭzi nespecifan plifortigon kaj redukti specifan plifortigan efikecon.Tre influas la kombinaĵon de enkondukoj kaj ŝablonoj por redukti PCR-amplifigan efikecon.Kelkfoje necesas uzi normajn termometrojn por detekti la ŝanĝeblecon, kalson kaj plilongigitan temperaturon en la etendo aŭ akvosolvebla kuirilo, kiu estas unu el la kialoj de la malsukceso de la PCR.
Cel-sekvencovariaĵoj: Se la celsekvenco okazas, mutacio aŭ forigo, la kombinaĵo de la prototipo kaj la ŝablono estas kombinitaj, aŭ pro la manko de celsekvenco, la enkonduko kaj la ŝablono perdos la komplementan sekvencon, kaj ĝia PCR-plifortigo ne estos sukcesa.
● Falsa pozitiva
La PCR-amplifiga bando prezentiĝas kongrua kun la celsekvencbendo, kaj foje ĝia grupo estas pli bonorda kaj pli alta.
Primer-dezajno ne taŭgas: la elektita plifortiga sekvenco kaj sencela plifortiga sekvenco havas homologa, do kiam PCR-amplifiĝo, la plifortigitaj PCR-produktoj estas necelaj sekvencoj.La celsekvenco estas tro mallonga aŭ la enkonduko estas tro mallonga, kaj ĝi estas ema al falsa pozitivo.Necesas esti restrukturita.
Krucpoluado de celsekvenco aŭ plifortigaj produktoj: Estas du kialoj por ĉi tiu poluado: Unue, krucpoluado de la tuta genaro aŭ grandaj segmentoj, kondukante al falsaj pozitivoj.Ĉi tiu speco de falsa pozitivo povas esti solvita per la sekvaj metodoj: Estu singarda kaj milda dum operacio por malhelpi la celsekvencon enspiru en la specimenan pafilon aŭ ŝpruci el la centrifuga tubo.Krom enzimoj kaj substancoj, kiuj ne povas elteni altajn temperaturojn, ĉiuj reakciiloj aŭ ekipaĵoj devas esti desinfektitaj per alta premo.La centrifugaj tuboj kaj specimenoj devas esti uzataj samtempe.Kiam necese, antaŭ ol aldoni specimenojn, la reagtubo kaj reakciilo estas elmontritaj al ultraviolaj radioj por detrui la ekzistantan nuklean acidon.Due, malgrandaj fragmentoj en la aerpoluo.Tiuj malgrandaj fragmentoj estas pli mallongaj ol la celsekvenco, sed ili havas certan homologion.Ĝi povas esti splisita unu kun la alia.Post kompletigado de la enkondukoj, la PCR-produkto povas esti vastigita, kio kaŭzos falsan pozitivan produktadon.Ĝi povas esti uzata por redukti aŭ forigi la nest-PCR-metodon.
● Aperu nespecifa plifortiga bando
La bandoj, kiuj aperis post PCR-plifortigo, malkongruas kun la atendata grandeco, aŭ grandaj aŭ malgrandaj, aŭ samtempe, aŭ samtempe, specifaj plifortigaj bandoj kaj nespecifaj plifortigaj bandoj.La apero de nespecifaj grupoj estas: Unue, la enkondukoj estas nekompletaj komplementaj al la celsekvenco, aŭ la polimerigo de la enkonduko por formi di areton.La dua estas, ke la koncentriĝo de MG2+jonoj estas tro alta, la kalcia temperaturo estas tro malalta, kaj la nombro da PCR-cikloj rilatas.Due, la kvalito kaj kvanto de enzimoj.Ofte, enzimoj de kelkaj fontoj estas emaj al ne-specialaj grupoj kaj la enzimoj de la alia fonto ne okazas.Foje nespecifa plifortigo de enzimoj ankaŭ okazas.La kontraŭrimedoj estas: re-dezajnitaj allogaj se necese.Reduktu la kvanton de enzimo aŭ anstataŭigu la enzimon de alia fonto.Reduktu la kvanton de primaraj, pliigu la kvanton de ŝablonoj taŭge kaj reduktu la nombron de cikloj.Ĝuste pliigu la kalsonan temperaturon aŭ uzu la metodon de du-temperaturaj punktoj (93°C degenero, kalcigado kaj etendiĝo je ĉirkaŭ 65°C).
● Aperu flokaj stupo aŭ ŝmiri bendo
PCR-plifortigo foje ŝajnas esti aplikata aŭ senŝeligita aŭ tapiŝ-simila zono.Pro la kialo, pro la troa kvanto de enzimoj aŭ la malbona kvalito de la enzimo, la dNTP-koncentriĝo estas tro alta, la Mg2+-koncentriĝo estas tro alta, la kalcia temperaturo estas tro malalta, kaj la nombro da cikloj estas tro multe.La kontraŭrimedoj estas: ①Malgrandigi la kvanton de enzimoj, aŭ ŝanĝi la enzimon de alia fonto.② Redukti la koncentriĝon de dNTP ③Taŭge reduktu la koncentriĝon de Mg2+.④ Pliigu la kvanton da ŝablonoj kaj redukti la nombron da cikloj.
Rilataj Produktoj
◮ Pli alta fideleco: 6 fojojn tiu de ordinara Taq-enzimo;
◮ Pli rapida plifortiga rapido
◮ Pli da ŝablona adaptebleco
◮ Pli alta plifortiga efikeco
◮ Media toleremo estas pli forta: metita je 37 °C dum semajno, konservante pli ol 90% agadon;
◮ Ĝi havas 5'→3' DNA-polimerazan agadon kaj 5'→3' eksonukleazan agadon, sen 3'→5' eksonukleazan agadon.
La unika reagsistemo kaj alt-efikeca Taq DNA Polymerase igas la PCR-reagon havi pli altan plifortigan efikecon, specifecon kaj sentemon.
RT-qPCR Easyᵀᴹ (Unu Paŝo) - SYBR Green I
◮ Unupaŝa ilaro faras inversan transskribon kaj qPCR du reagojn en la sama tubo, nur bezonas aldoni ŝablonon RNA, specifajn PCR-komencojn kaj RNase-Sen ddH.2O.
◮ La ilaro povas rapide kaj efike kvante analizi virusan RNA aŭ spuri RNA.
◮ La ilaro uzas unikan reakciilon de inversa transskribo de Foregene kaj Foregene HotStar Taq DNA Polymerase kombinita kun unika reagsistemo por efike plibonigi la plifortigan efikecon kaj specifecon de la reago.
◮ La optimumigita reagsistemo igas la reakcion havi pli altan detektan sentivecon, pli fortan termikan stabilecon kaj pli bonan toleremon.
◮ RT-qPCR FacilaTM(Unu Paŝo) -SYBR Green I-ilaro venas kun interna referenca tinkturo de ROX, kiu povas esti uzata por forigi signalajn fonojn kaj signalajn erarojn inter putoj, kio estas oportuna por klientoj uzi en malsamaj modeloj de kvantaj PCR-instrumentoj.
RT FacilaTMII (Mastra Premiksaĵo por unuafadena cDNA sintezo porRealtempa PCR)
-Efika kapablo forigi gDNA, kiu povas forigi gDNA en la ŝablono ene de 2 minutoj.
-Efika inversa transskriba sistemo, necesas nur 15 minutoj por kompletigi la sintezon de la unua fadeno cDNA.
-Kompleksaj ŝablonoj: ŝablonoj kun alta GC-enhavo kaj kompleksa malĉefa strukturo ankaŭ povas esti inversigitaj kun alta efikeco.
-Alt-sentema inversa transskriba sistemo, pg-nivelaj ŝablonoj ankaŭ povas akiri altkvalitan cDNA.
-La inversa transskriba sistemo havas altan termikan stabilecon, la optimuma reakcia temperaturo estas 42℃, kaj ĝi ankoraŭ havas bonan inversan transskriban rendimenton je 50℃.
Afiŝtempo: Mar-18-2023
