RT-qPCR estas la baza eksperimento de molekula biologio, kaj ĉiuj devas koni ĝin.Ĝi plejparte inkluzivas tri ŝtupojn: RNA-ekstraktado, inversa transskribo en cDNA, kaj realtempa fluoreska kvanta PCR.Ĝi ne helpas, kio okazas?Verŝajne estas problemo kunla inversa transskriba eksperimento!Kvankam ŝajnas, ke la inversa transskriba eksperimento nur bezonas aldoni RNA, dNTP, enkondukojn, kajinversa transskribazoal la centrifugila tubo kaj miksi bone, sed en la reala operacio procezo, estas ankoraŭ multaj detaloj, kiujn oni devas atenti.Ni lernu pri ĝi!

Kiel juĝi la kvaliton de RNA?
Por akiri cDNA, la kvalito de RNA estas kritika!RNA-kvalito povas esti detektita plejparte de du aspektoj:
(1) RNA-integreco:RNA-integreco povas esti kontrolita per agaroza ĝelelektroforezo. Prenante eŭkariotojn kiel ekzemplon, la kompleta totala RNA havas tri klarajn bendojn, la molekulaj pezoj de granda ĝis malgranda estas 28S, 18S, kaj 5S, kaj 28S estas duoble pli helaj ol 18S;se oni povas vidi tri bendojn, sed la bandospeco estas malklara aŭ Disvastigo signifas ke la RNA estas parte degradita.Nuntempe, bonvolu plenumi la inversan transskriban reagon tuj kaj pliigi la ŝablonon enigo taŭge;se nur bendo kun malgranda molekula pezo aŭ neniu bendo povas esti vidita, la RNA estis tute degradita kaj devas esti re-eltirita.Agilent 2100 indikas la integrecon de RNA kun pintdiagramo kaj RIN-valoro.Se la nuklea acido estas sendifekta, la bazlinio de la elektroferogramo estas plata;se la nuklea acido estas grave degradita, la bazlinio estas neegala kaj pli da degradaj pintoj aperas;la valoro de RIN reflektas la integrecon de la RNA, ene de la intervalo de 0-10, ju pli granda la valoro, des pli bona la kvalito de la RNA.Nu, ju pli alta estas la grado de kompleteco.
(2) Pureco de RNA:La proporcio de OD260/280 povas esti detektita per UV-spektrofotometrio.Se la proporcio de OD260/280 estas inter 1.9 kaj 2.1, la pureco estas tre bona.
Resta genoma DNA povas konduki al malprecizaj kvantaj rezultoj
Kiam RNA estas ĉerpita, la RNA kiun ni ricevas povas esti miksita kun genoma DNA (gDNA) kiu ne estis purigita.Tial, la cDNA post inversa transskribo ankaŭ estos miksita kungDNA.Dum la laŭflueqPCRreago,cDNAkaj gDNA povas esti plifortigita samtempe, rezultigante relative malgrandan CT-valoron, tiel ke la rezultoj povas esti partiaj.
Kion do ni faru en ĉi tiu situacio?Antaŭgenosugestas:
(1) Faru genoman purigadon sur la inversigita RNA, kiu povas esti forigita per kolumna eltiro dum RNA-eltiro;
(2) Traktu la ĉerpitan RNA kun DNaseI , sed fini ĝin per EDTA;
de inversa transskriba reakciilojkun moduloj de purigado de genaro;

Kiel elekti enkondukojn por inversa transskribo?
Inversa transskribaj enkondukoj ankaŭ influas la rezulton de la inversa transskriba reago.Vi povas elekti hazardajn enkondukojn, Oligo dT aŭ gen-specifajn enkondukojn por inversa transskribo laŭ la specifaj cirkonstancoj de la eksperimento:
(1) Specifaj transskribaĵoj: genospecifaj enkondukoj estas rekomenditaj;
(2) Longaj fragmentaj transskribaĵoj: Oligo dT/gen-specifaj enkondukoj estas rekomenditaj;
(3) Internaj fragmentoj de long-segmentaj transskribaĵoj: genospecifaj enkondukoj/ hazardaj enkondukoj /hazardaj enkondukoj + Oligo dT.Se la posta qPCR-eksperimento estas farita, Oligo dT ne povas esti uzita sole, ĉar uzi Oligo dT sole povas kaŭzi 3′ finbiason, kondukante al malprecizaj qPCR-eksperimentrezultoj;
(4) miRNA: Tigo-buklaj enkondukoj aŭ vostaj enkondukoj povas esti uzataj.

Kiom da fojoj la inversa transskriba produkto cDNA estu diluita por kvantigo?
Post akiri la cDNA de la inversa transskriba produkto, kiom da fojoj la cDNA devus esti diluita por qPCR-eksperimentoj estas tre grava.Se la cDNA-koncentriĝo estas tro alta aŭ tro malalta, la plifortiga efikeco povas esti tuŝita.Ĉu la cDNA-koncentriĝo povas esti mezurita, kaj kiel ĝi devus esti farita?
(1) La cDNA-koncentriĝo de la inversa transskriba produkto ne povas esti mezurita, ĉar krom la cDNA-produkto, la inversa transskriba produkto ankaŭ enhavas inversan transskriban restan Buffer, inversan transkriptazon, enkondukojn, ktp., kiuj malhelpos la koncentriĝmezurrezultojn kaj kaŭzos OD260/280, OD260/ 230-proporcion ne reflektas veran cDN-on kaj tial ne reflektas nenormalan rilatumon.En ĉi tiu tempo, iuj amikoj diros, tiam mi mezuros la koncentriĝon post puriĝo;ĉi tie,Foregene ŝatus memorigi, ke la cDNA ne rekomendas esti purigita, ĉar la longo de la cDNA akirita per la inversigo estas malsama, kaj la mallonga cDNA perdiĝos en la purigo.
(2) Kion do fari?Antaŭ la qPCR-eksperimento, la diluogradiento de la cDNA povas esti determinita tra la antaŭ-eksperimento.Ekzemple: uzu cDNA-akcian solvon, 10-oblan diluon kaj 100-oblan diluon kiel ŝablonojn por qPCR-eksperimentoj, kaj elektu la diluan faktoron kun CT-valoro en la intervalo de 18-28.

Kiel miRNA-oj estu inverse transskribitaj?
miRNA estas unu-fadena malgranda molekulo RNA kun grandeco de proksimume 22 nt kiu ne kodas por proteino.Pro ĝia mallonga longo, konvencia qPCR-metodo malfacilas rekte kvantigi ĝin, tiel ke estas ofte necese etendi miRNA;la ofte uzitaj inverstransskribaj metodoj por miRNA inkludas tig-buklan metodon kaj vostometodon.
La tig-bukla metodo devas etendi la miRNA aldonante tig-buklajn enkondukojn.Ĉi tiu detektometodo havas pli altan sentemon kaj specifecon, sed la detekta trairo estas malalta.Unu inversa transskribo povas nur detekti unu miRNA kaj internan referencon;la vosto-aldona metodo estas kunmetita de du Ĝi estas kompletigita per la kuna ago de du enzimoj, kiuj estas PolyA polimerazo kaj inversa transkriptazo.PolyA-polimerazo respondecas pri aldonado de PolyA-vostoj al miRNA por pliigi ĝian longon, kaj inversa transkriptazo elfaras inversan transskriban reagon.Tiu metodo havas altan detektan trairon kaj povas detekti multoblajn miRNA'ojn kaj internajn referencojn en unu inversa transskribo, sed la sentemo kaj specifeco estas malaltaj en la tigo-bukla metodo.