Real Time PCR, ankaŭ konata kiel kvanta PCR aŭ qPCR, estas metodo por realtempa monitorado kaj analizo de PCR-plifortproduktoj.
Ĉar kvanta PCR havas la avantaĝojn de simpla funkciado, rapida kaj oportuna, alta sentemo, bona ripeteblo kaj malalta poluado-procento, ĝi estas vaste uzata en medicina testado, taksado de efikeco de drogoj, esploro pri gen-esprimo, transgena esplorado, gen-detekto, patogen-detekto, detekto de bestoj kaj plantoj., manĝtestado kaj aliaj kampoj.
Sekve, ĉu vi okupiĝas pri baza esploro pri vivsciencoj, ĉu dungitoj de farmaciaj kompanioj, bredadaj kompanioj, manĝaĵaj kompanioj aŭ eĉ dungitoj de enir-eliro-inspektado kaj kvarantena oficejoj, fakoj pri media monitorado, hospitaloj kaj aliaj unuoj, vi estos pli-malpli elmontrita al Aŭ vi devas scii la scion pri majstrado de kvanta PCR.

Principo de Reala Tempo PCR

Real Time PCR estas metodo en kiu fluoreskaj substancoj estas aldonitaj al la PCR-reaga sistemo, kaj la fluoreska signala intenseco en la procezo de PCR-reago estas monitorita en reala tempo per kvanta PCR-instrumento, kaj finfine la eksperimentaj datumoj estas analizitaj kaj prilaboritaj.

【Plifortiga kurbo】estas la kurbo priskribanta la dinamikan procezon de PCR.La plifortiga kurbo de PCR ne estas fakte norma eksponenta kurbo, sed sigmoida kurbo.

[Platforma fazo de plifortiga kurbo]Kun la pliiĝo de la nombro da PCR-cikloj, la malaktivigo de DNA-polimerazo, la malplenigo de dNTPoj kaj enkondukoj, kaj la inhibicio de la sinteza reago per la reakcia kromprodukta pirofosfato, ktp., la PCR ne ĉiam disetendiĝas eksponente., kaj poste eniros altebenaĵon.

[Eksponenta Kreska Regiono de Plifortiga Kurbo]Kvankam la altebenaĵa fazo multe varias, en certa regiono de la eksponenta kreskoregiono de la plifortiga kurbo, la ripeteblo estas tre bona, kio estas tre grava por kvanta analizo de PCR.

[Sojla valoro kaj Ct-valoro]Ni fiksas la limvaloron de fluoreskeca detekto ĉe la taŭga pozicio en la eksponenta kreska areo de la plifortiga kurbo, nome la sojla valoro (Sojlo).La intersekco de la sojla valoro kaj la plifortiga kurbo estas la Ct-valoro, tio estas, la Ct-valoro rilatas al la nombro da cikloj (Threshold Cycle) kiam la sojla valoro estas atingita.

La suba grafikaĵo klare montras la rilaton inter sojla linio kaj plifortiga kurbo, sojlo kaj Ct-valoro.

【Kiel kvantigi?】

Estis pruvite per matematika teorio ke la Ct-valoro havas inversan linearan rilaton kun la logaritmo de la nombro da komencaj ŝablonoj.Real Time PCR monitoras PCR-plifortproduktojn en reala tempo kaj kvantigas ilin dum la eksponenta plifortfazo.

Por ĉiu ciklo de PCR, la DNA pliiĝis eksponente je 2 fojojn, kaj baldaŭ atingis altebenaĵon.

Supozante ke la kvanto de komenca DNA estas A₀ , post n cikloj, la teoria kvanto de DNA-produkto povas esti esprimita kiel:

A _n =A ₀ ×2ⁿ

Tiam, ju pli la komenca DNA-kvanto A 0 estas, des pli frue la kvanto de la amplifita produkto atingas la detektan valoron An , kaj la nombro da cikloj atinginte An estas la Ct-valoro.Tio estas, ju pli la komenca DNA-kvanto A 0 estas, des pli frue la plifortiga kurbo pintoj, kaj des la bezonata nombro da cikloj n estas pli malgranda.

Ni efektivigas gradientdiluon de la normo de konata koncentriĝo kaj uzas ĝin kiel ŝablonon por Reala Tempo PCR, kaj serio da plifortigaj kurboj estos akiritaj je egalaj intervaloj en la ordo de komenca DNA-kvanto de pli al malpli.Laŭ la linia rilato inter la Ct-valoro kaj la logaritmo de la nombro da komencaj ŝablonoj, a[norma kurbo] povas esti kreita.

Anstataŭigante la Ct-valoron de la provaĵo kun nekonata koncentriĝo en la norman kurbon, la komenca ŝablonkvanto de la provaĵo kun nekonata koncentriĝo povas esti akirita, kio estas la kvanta principo de Real Time PCR.

Detekta metodo de Real Time PCR

Real Time PCR detektas PCR-plifortproduktojn detektante la fluoreskecintensecon en la reagsistemo.

Principo de Fluoreska Tinkturfarba Enkonstrua Metodo】

Fluoreskaj tinkturfarboj, kiel ekzemple TB Green ® , povas nespecife ligi al duoble-fadena DNA en PCR-sistemoj kaj fluoreski sur ligado.

La fluoreskecintenseco en la reagsistemo pliiĝis eksponente kun la pliiĝo de PCR-cikloj.Detektante la fluoreskecintensecon, la kvanto de DNA-plifortigo en la reagsistemo povas esti monitorita en reala tempo, kaj tiam la kvanto de la startŝablono en la provaĵo povas esti inverse taksita.

【Principo de fluoreska sonda metodo】

fluoreska sondiloestas nuklea acida sekvenco kun fluoreska grupo ĉe la 5′ fino kaj estinga grupo ĉe la 3′ fino, kiu povas specife ligi al la ŝablono.Kiam la enketo estas sendifekta, la fluoreskeco elsendita per la fluoroforo estas estingita fare de la estinga grupo kaj ne povas fluoreskeci.Kiam la enketo estas malkomponita, la fluoreska substanco disiĝos kaj elsendos fluoreskecon.

Fluoreska enketo estas aldonita al la PCR-reagsolvo.Dum la kalcia procezo, la fluoreska sondilo ligos al la specifa pozicio de la ŝablono.Dum la etendprocezo, la 5′→3′ eksonukleazaktiveco de la PCR-enzimo povas malkomponi la fluoreskecan enketon hibridigitan kun la ŝablono, kaj la fluoreska substanco estas disigita por elsendi fluoreskecon.Detektante la fluoreskecan intensecon de la enketo en la reagsistemo, la celo de monitorado de la plifortiga kvanto de la PCR-produkto povas esti atingita.

【Elekto de Fluoreskeca Detekta Metodo】

Se ĝi kutimas distingi sekvencojn kun alta homologio kaj elfari plurteksan PCR-detekton kiel ekzemple SNP-tajpanalizo, la fluoreska enketmetodo estas neanstataŭebla.
Por aliaj Real Time PCR-eksperimentoj, simpla, facila kaj malmultekosta fluoreska ĥimera metodo povas esti uzata.

enketojForta specifeco, kapabla je multeksa PCR

Manko

Altaj specifecpostuloj por plifortigo;

multiplex PCR ne povas esti faritaDevas desegni specifajn sondilojn, alta kosto;

foje enketdezajno estas malfacila

Rilataj Produktoj: