Ct-valoro estas la plej grava rezulta prezentformo de fluoreska kvanta PCR.Ĝi estas uzata por kalkuli gen-esprimdiferencojn aŭ genan kopinombron.Do kio estas la Ct-valoro de fluoreskeca kvantigo konsiderata racia?Kiel certigi la efikan gamon de Ct-valoro?
Kio estas Ct-valoro?
Dum la qPCR plifortiga procezo, la responda nombro da plifortigaj cikloj (Cycle Threshold) kiam la fluoreskeca signalo de la plifortigita produkto atingas la fiksitan fluoreskecsojlon.C signifas Ciklo kaj T signifas Sojlo.Simple dirite, la Ct-valoro estas la nombro da cikloj egalrilatantaj al kiam la komenca ŝablonplifortigo atingas certan kvanton de produkto en qPCR.La tiel nomata "certa kvanto da produkto" estos plu klarigita poste.
Kion faras la Ct-valoro?
1.Rilato inter eksponenta plifortigo, ŝablonkvanto kaj Ct-valoro
Ideale, genoj en qPCR estas akumulitaj per eksponenta plifortigo post certa nombro da cikloj.La rilato inter la nombro da plifortigaj cikloj kaj la kvanto da produktoj estas: Plifortigita produktokvanto = komenca ŝablonkvanto × (1+En) ciklonombro.Tamen, la qPCR-reago ne ĉiam estas en ideala situacio.Kiam la kvanto de plifortigita produkto atingas "certan produktokvanton", la nombro da cikloj en ĉi tiu tempo estas la Ct-valoro, kaj ĝi estas en la eksponenta plifortiga periodo.La rilato inter la Ct-valoro kaj la kvanto de komenca ŝablono: Estas linia rilato inter la Ct-valoro de la ŝablono kaj la logaritmo de la komenca kopinumero de la ŝablono.Ju pli alta la komenca ŝablonkoncentriĝo, des pli malgranda la Ct-valoro;ju pli malalta la komenca ŝablonkoncentriĝo, des pli granda la Ct-valoro.
2.Amplifica kurbo, fluoreskeca sojlo kaj certa PCR-produkta kvanto
La kvanto de qPCR plifortiga produkto estas rekte prezentita en formo de fluoreska signalo, tio estas, la plifortiga kurbo.En la frua etapo de PCR, la plifortigo estas en idealaj kondiĉoj, la nombro da cikloj estas malgranda, la produktamasiĝo estas malgranda, kaj la fluoreskeca nivelo ne povas esti klare distingita de la fluoreskeca fono.Post tio, la fluoreskeco pliiĝas kaj eniras la eksponencan fazon.La kvanto de PCR-produkto povas esti detektita en certa punkto kiam la PCR-reago estas nur en la eksponenta fazo, kiu povas esti uzata kiel "certa kvanto da produkto", kaj la komenca enhavo de la ŝablono povas esti deduktita de ĉi tio.Tial, la fluoreskeca signalintenso egalrilatanta al certa kvanto de produkto estas la fluoreskeca sojlo.
En la malfrua stadio de PCR, la plifortiga kurbo ne plu montras eksponencan plifortigon, kaj eniras la linearan fazon kaj altebenaĵan fazon.
3.Reproduktebleco de Ct-valoroj
Kiam la PCR-ciklo atingas la ciklonumeron de la Ct-valoro, ĝi ĵus eniris la veran eksponenta plifortigan periodon.Nuntempe, la malgranda eraro ne estis plifortigita, do la reproduktebleco de la Ct-valoro estas bonega, tio estas, la sama ŝablono estas plifortigita en malsamaj tempoj aŭ en malsamaj tuboj samtempe.Plifortigo, la akirita Ct-valoro estas konstanta.
1.Amplification efikeco En
PCR plifortiga efikeco rilatas al la efikeco kun kiu la polimerazo transformas la genon por esti plifortigita en amplikonon.La plifortiga efikeco kiam unu DNA-molekulo estas transformita en du DNA-molekulojn estas 100%.Plifortiga efikeco estas ofte esprimita kiel En.Por faciligi la analizon de postaj artikoloj, la faktoroj kiuj influas la plifortigan efikecon estas mallonge enkondukitaj.
| Influaj faktoroj | klarigo | Kiel juĝi? |
| A. PCR-inhibitoroj | 1. La ŝablono DNA enhavas substancojn kiuj malhelpas la PCR-reagon, kiel proteinojn aŭ detergentojn.2. La cDNA post inversa transskribo enhavas altan koncentriĝon de ŝablonoj RNA aŭ RT-reakciiloj, kiuj ankaŭ povas malhelpi la postan PCR-reagon. | 1. Ĉu estas poluado, oni povas juĝi per mezurado de la proporcio de A260/A280 kaj A260/A230 aŭ RNA-elektroforezo.2. Ĉu la cDNA estas diluita laŭ certa proporcio post inversa transskribo. |
| B. Nekonvena enkonduka dezajno | Primeroj ne kalmas efike | Kontrolu enkondukojn por enkonduko-dimeroj aŭ harpingloj, miskongruoj, kaj foje ampleksantaj intronajn dezajnojn. |
| C. Malpropra PCR-reaga programo-dezajno | 1. Primeroj ne povas efike rekuiri2. Nesufiĉa liberigo de DNA-polimerazo 3. Longtempa alta temperaturo DNA-polimeraza aktiveco malpliiĝis | 1. La annealing temperaturo estas pli alta ol la TM-valoro de la primer2. Antaŭ-malnatura tempo estas tro mallonga 3. La tempo de ĉiu etapo de la reakcia proceduro estas tro longa |
| D. Nesufiĉa miksado de reakciiloj aŭ pipetaj eraroj | En la reagsistemo, la loka koncentriĝo de PCR-reagaj komponantoj estas tro alta aŭ neegala, rezultigante ne-eksponencan plifortigon de PCR-amplifilo. | |
| E. Amplikon Longo | La longo de la amplikono estas tro longa, superante 300bp, kaj la plifortiga efikeco estas malalta | Kontrolu, ke la amplikona longo estas inter 80-300bp |
| F. Influo de qPCR-reakciiloj | La koncentriĝo de DNA-polimerazo en la reakciilo estas malalta aŭ la koncentriĝo de jonoj en la bufro ne estas optimumigita, rezultigante la Taq-enzimaktivecon ne atingante la maksimumon. | Determino de plifortiga efikeco per norma kurbo |
2.Range de Ct-valoroj
Ct-valoroj varias de 15-35.Se la Ct-valoro estas malpli ol 15, oni konsideras ke la plifortigo estas ene de la intervalo de la bazlinioperiodo kaj la fluoreskeca sojlo ne estis atingita.Ideale, ekzistas linia rilato inter la Ct-valoro kaj la logaritmo de la komenca kopinombro de la ŝablono, tio estas, la norma kurbo.Tra la norma kurbo, kiam la plifortiga efikeco estas 100%, la kalkulita Ct-valoro por kvantigi la ununuran kopian nombron de la geno estas proksimume 35. Se ĝi estas pli granda ol 35, la komenca kopinumero de la ŝablono estas teorie malpli ol 1, kio povas esti konsiderata sensenca.
Por malsamaj genaj Ct-intervaloj, pro la diferenco en gena kopinombro kaj plifortiga efikeco en la komenca ŝablonkvanto, estas necese fari norman kurbon por la geno kaj kalkuli la linearan detektintervalon de la geno.
3.Influaj faktoroj de Ct-valoro
De la rilato inter la nombro de plifortigaj cikloj kaj la kvanto de produkto: kvanto de plifortigita produkto = kvanto de komenca ŝablono × (1+En) ciklonombro, oni povas vidi, ke en idealaj kondiĉoj, la kvanto de komenca ŝablono kaj En havos negativan efikon sur Ct-valoro estas tuŝita.La diferenco en ŝablonkvalito aŭ plifortiga efikeco igos la Ct-valoron esti tro granda aŭ tro malgranda.
4.Ct-valoro estas tro granda aŭ tro malgranda
Afiŝtempo: Feb-22-2023
