La elstara trajto de la PCR-reago estas sia granda plifortiga kapablo kaj ekstreme alta sentemo.Por plibonigi PCR-agadon kaj detektan efikecon, ni kompromitas plibonigi la PCR-amplifigan kapablon kaj detektan sentivecon, sed la kapdoloro estas en la procezo de la eksperimento.Malveraj pozitivoj ofte okazas, kaj tre malgranda kvanto de prova kruc-poluado aŭ PCR-produkta poluado povas kaŭzi falsajn pozitivojn en la eksperimento.
Kvin specoj de PCR-produkta poluado
Estas multaj kialoj de PCR-poluado, kiuj povas esti proksimume dividitaj en la sekvajn kategoriojn:
Specimenpoluado estas ĉefe kaŭzita de la poluado de la ujo por kolekti la specimenon, aŭ kiam la specimeno estas metita, ĝi estas likita el la ujo pro malfiksa sigelo, aŭ la specimeno estas aligita al la ekstero de la ujo, kiu kaŭzas kruc-poluadon;Poluado kondukas al poluado inter specimenoj;iuj mikrobaj specimenoj, precipe virusoj, povas disvastiĝi kun aerosoloj aŭ formi aerosolojn, rezultigante reciprokan poluadon.
La ĉefa kialo estas, ke dum la preparado de PCR-reakciiloj, la specimena pafilo, ujo, duobla distilita akvo kaj aliaj solvoj estas poluitaj de la PCR-nukleacida ŝablono.
En molekula biologia laboratorioj kaj kelkaj laboratorioj kiuj utiligas klonitajn plasmidojn kiel pozitivajn kontrolojn, la problemo de klonita plasmidpoluado ankaŭ estas ofta.Ĉar la enhavo de klonado de plasmido en unuovolumo estas sufiĉe alta, kaj pli da iloj kaj reakciiloj estas bezonataj en la purigprocezo, kaj la plasmido en vivantaj ĉeloj tre verŝajne estos poluita pro la forta kresko kaj reproduktadkapablo de vivantaj ĉeloj.
La poluado de plifortigitaj produktoj estas la plej ofta poluada problemo en PCR-reagoj.Ĉar la kopikvanto de PCR-produkto estas granda (ĝenerale 1013 kopioj/ml), kio estas multe pli alta ol la limo de PCR-detekta kopinombro, tre malgranda kvanto de PCR-produkta poluado povas kaŭzi falsajn pozitivojn.
Aerosolpoluado estas la plej verŝajna formo de poluado de PCR-produktoj, kaj ĝi estas ankaŭ la plej facila por esti preteratentita.Ĝi estas formita de la frotado inter la likva surfaco kaj la aero.Ĝenerale, aerosolpoluado povas esti formita kiam la kovrilo estas malfermita, kiam la specimeno estas aspirita, aŭ eĉ kiam la reagtubo estas vigle skuita.Laŭ kalkuloj aerosola partiklo povas enhavi 48 000 ekzemplerojn, do la poluado kaŭzita de ĝi estas problemo, kiu meritas specialan atenton.
Aparte, testaj laboratorioj ofte uzas la saman paron de enkondukoj por testi certan genon.Kun la tempo, granda kvanto da PCR-produkta poluado okazos en la laboratoriospaco.Post kiam tia poluado okazas, estas malfacile forigi ĝin en mallonga tempo.
Por la unuaj tri specoj de poluado, ni povas uzi efikajn rimedojn por eviti, sed la poluado kaŭzita de PCR-produktoj malfacilas malhelpi, precipe en la konstruado de ne-normaj PCR-laboratorioj.En la PCR-procezo, kiam la pipetpinto suĉas kaj blovas la likvaĵon, kaj la PCR-tuba kovrilo estas malfermita, aerosolo formiĝos.La DNA-molekuloj portitaj de la aerosolo (unu aerosolo povas porti dekojn da miloj da DNA) estas malfacile elimineblaj ĉar ili flosas en la aero.Post kiam la sekva rondo de PCR-eksperimentoj estas lanĉita, falsaj pozitivoj neeviteble okazos.
Kiel montrite en la figuro malsupre, la negativa kontrolo ankaŭ plifortigis la ekvivalentan grupon de intereso:
La unua parto de ĉi tiu temo de PCR-poluo kaj prevento estas prezentita ĉi tie.La sekva numero alportos al vi la duan parton "Preventado de PCR-produkta poluado", do atentu!
Afiŝtempo: Jul-25-2017
