Mi kredas, ke ĉiuj ĉiam renkontos tiajn aŭ tiajn problemojn kiam ili faras PCR-reagojn, sed la plej multaj el ili povas esti klasifikitaj en du ĉefajn problemojn:

Tro malmulte da plifortigo de la genŝablono (plifortigo);
Tro da ne-cela gena plifortigo.
Uzado de aldonaĵoj estas unu el la komunaj strategioj por solvi ĉi tiujn problemojn.Kutime la rolo de aldonaĵoj havas du aspektojn:
sekundara strukturode genoj (sekundara strukturo);
Redukti nespecifan amoron.
Hodiaŭ, la redaktisto mallonge konigos al vi la komunajn aldonaĵojn en PCR-reagoj kaj iliajn funkciojn.
Aldonaĵoj kiuj reduktas sekundaran strukturon
sulfoksido(DMSO)
genspecimenojkun alta GC-enhavo.Tamen, DMSO ankaŭ tre reduktas Taq-polimerazaktivecon.Sekve, ĉiuj devas ekvilibrigi la ŝablonon alireblecon kaj la agadon de la polimerazo.La redaktisto sugestas, ke vi povas provi malsamajn koncentriĝojn de DSMO, kiel de 2% ĝis 10%, por trovi la koncentriĝon kiu konvenas al via eksperimento.
Ne-jonaj lesivoj
Ne-jonaj lesivoj, kiel ekzemple 0,1-1% Triton X-100, Tween 20 aŭ NP-40, kutime reduktas DNA-sekundaran strukturon.Kvankam tio povas pliigi la plifortigon de la ŝablongeno, ĝi ankaŭ kaŭzos la problemon de nespecifa plifortigo.Do, ĉi tiuj aldonaĵoj funkcias bone por malalt-rendimentaj PCR-reagoj sen derompaĵoj, sed ne tiel bone por relative malpuraj PRC-reagoj.Alia avantaĝo de ne-jonaj lesivoj estas la redukto de SDS-poluado.Kutime dum la procezo de eltiro de DNA, SDS estos alportita al la PCR-ŝtupo, kiu tre malhelpas la agadon de la polimerazo.Tial, aldoni 0.5% Tween-20 aŭ Tween-40 al la reago povas neŭtraligi la negativajn efikojn de SDS.
Betaine_
Betaino povas plibonigi DNA-plifortigon reduktante sekundaran strukturformadon kaj estas ĝenerale "mistera" aldono al komercaj PCR-kompletoj.Se vi volas uzi betainon, vi devus meti betainon aŭ betainan monohidraton (Betaine aŭ Betaine monohidraton), sed ne betaine-klorhidraton (Betaine HCl), ĝustigu al fina koncentriĝo de 1-1.7M.Betaino ankaŭ povas helpi plibonigi specifecon ĉar ĝi eliminas la bazparkonsistan dependecon de DNA-fandado/DNA-malnaturado.
Aldonaĵoj por redukti nespecifan amoron
Formamido
Formamido estas ofte uzata organika PCR-aldonaĵo.Ĝi povas kombini kun plej granda sulko kaj negrava sulko en DNA, tiel reduktante la stabilecon de la majstra DNA duobla helico kaj malaltigante la fandan temperaturon de DNA.La koncentriĝo de formamido uzita en PCR-eksperimentoj estas kutime 1%-5%.
Tetrametiloamonia klorido( TMAC)
Tetrametilamonia klorido povas pliigi la specifecon de hibridigo (hibridigspecifeco) kaj pliigi la fandan temperaturon de DNA.Tiel, TMAC povas forigi nespecifan preparigon kaj redukti misligadon de DNA kaj RNA.Se vi uzasdegeneritaj enkondukojen la PCR-reago, memoru aldoni TMAC, kiu estas kutime uzata ĉe koncentriĝo de 15-100mM.
Aliaj Oftaj Aldonaĵoj
Krom la du kategorioj de aldonaĵoj menciitaj supre, ekzistas multaj oftaj aldonaĵoj en PCR-reagoj, kvankam ili havas malsamajn funkciojn, ili ankaŭ estas tre gravaj.
Magnezia jono
Magneziojono estas nemalhavebla kofaktoro (kofaktoro) de polimerazo, tio estas, sen magneziojono, polimerazo estas neaktiva.Tamen, tro da magneziojonoj ankaŭ povas influi la efikecon de la polimerazo.La koncentriĝo de magneziojonoj en ĉiu PCR-reago varias.Chelating agentoj (kiel ekzemple EDTA aŭ citrato), la koncentriĝo de dNTPoj kaj proteinoj ĉiuj influas la koncentriĝon de magneziojonoj.Do, se vi havas problemojn kun via PCR-eksperimento, vi povas provi ŝanĝi malsamajn koncentriĝojn de magneziojon, ekzemple, de 1.0 al 4.0mM, kun intervalo de 0.5-1mM intere.
Indas noti, ke multoblaj frostiĝ-degelaj cikloj povas konduki al koncentriĝtavoliĝo de la magnezia klorida solvaĵo.Tial vi devas tute solvi ĝin antaŭ ĉiu uzo, kaj bone miksi ĝin antaŭ ol uzi ĝin.
Bova seruma albumino(Bova albumino, BSA)
En molekula kemiaj eksperimentoj, bova serumalbumino estas tre ofta aldonaĵo, precipe en restrikta enzimdigestado kaj PCR-eksperimentoj.En PCR-reagoj, BSA estas helpema en reduktado de poluaĵoj kiel ekzemple fenolaj kunmetaĵoj.Kaj ankaŭ oni diras, ke ĝi povas redukti la adheron de reakciantoj al la muro de la provtubo.En la PCR-reago, kutime la koncentriĝo de BSA aldonita povas atingi 0.8 mg/ml.
 
Rilataj Produktoj:
PCR Hero(kun tinkturfarbo)
PCR Hero