Tradiciaj inversaj transkriptazoj ne povas toleri altajn temperaturojn (la optimuma temperaturo por MMLV-agado estas 37-50 °C, kaj AMV estas 42-60 °C).La pli kompleksa virusa RNA ne povas esti efike inverse transskribita en cDNA ĉe malaltaj temperaturoj, rezultigante detektefikecon La redukto.Tradicia RT-qPCR ĝenerale postulas la partoprenon de du ŝlosilaj enzimoj (inversa transkriptazo kaj DNA-polimerazo), kio malebligas simpligi la operacion de la reagsistemo kaj redukti la koston.Ĉi tie ni enkondukos du alttemperaturrezistajn inversajn transkriptazon, TtH kaj RevTaq.Ĉi tiuj du enzimoj ankaŭ havas la funkcion de DNA-polimerazo, do ili estas nomitaj dufunkciaj enzimoj.

TtH DNA-polimerazo

Vi certe aŭdis pri TtH, kiu devenas de la termofila bakterio Thermus thermophilus HB8.En la ĉeesto de divalentaj katjonoj kiel ekzemple Mg2+, ĝi havas DNA-polimerazaktivecon.Ĝi estas vaste uzata en PCR-reagoj kiel Taq-enzimo, sed ĝi havas pli altan varmoreziston ol Taq-enzimo, do ĝi ankaŭ havas pli bonan efikon al PCR kun altaj GC-enhavaj ŝablonoj.

· Ĉi tiu enzimo esence ne havas 3′→5′ eksonukleazan agadon kaj 5′→3′ eksonukleazan agadon, do ĝi ankaŭ povas esti uzata por dideoksia sinsekvo.

· Ĉi tiu enzimo havas RTase-aktivecon.En ĉeesto de Mn2+, RTase-agado estos plifortigita.Uzante ĉi tiun funkcion, ĝi povas esti uzata por realigi inversan transskriban reagon kaj PCR-reagon en la sama tubo, tio estas, unupaŝa RT-PCR.Tamen, en la ĉeesto de Mn2+, la precizeco de RT-PCR ne estas alta.RT-agado havas nenion komunan kun rnaase H-agado.

· La pliigita aktiveco de Tth-DNA polimerazo (pH9, optimuma +55℃～+70℃, maksimuma +95℃) venkas la problemojn kaŭzitajn de RNA sekundara strukturo.La rezulta cDNA povas esti plifortigita per PCR kun la sama enzimo en la ĉeesto de Mg2+ jonoj.

· La kapablo de Tth-DNA polimerazo fari inversan transskribon kaj DNA-plifortigon ĉe altaj temperaturoj faras ĉi tiun enzimon utila por kvanta RT-PCR, klonado kaj gen-esprima analizo de ĉela kaj virusa RNA.
· Tth-DNA polimerazo estas uzata por RT-PCR por plifortigi RNA ĝis 1kb.

Karakterizaĵoj kaj avantaĝoj

T-a DNA-polimerazo:

• Certigu la optimumigitan produktograndecon de la polimera ĉena reago (PCR), almenaŭ 1000 bp en la reago RT-PCR

• Akceptu modifitan deoksirribonukleosidan trifosfaton kiel substraton

• Ne rilata al agado de RNase H

• Havas altan termikan stabilecon por venki problemojn, kutime rilatajn al la alta sekundara strukturo ĉeestanta en RNA

RevTaq RT-PCR DNA-polimerazo

Varmrezista DNA-polimerazo kun inversa transkriptaza agado

RevTaq-RT-PCR-DNA polimerazo estas realigita, tre varmecrezista, duoble-funkcia enzimo kun inversa transkriptazo kaj DNA-polimerazo-agadoj akiritaj per direktita kaj artefarita evoluo.

· La duoniĝotempo de RevTaq RT-PCR DNA-polimerazo je 95 °C estas pli granda ol 40 minutoj.

· RevTaq RT-PCR DNA-polimerazo permesas alt-temperaturan inversan transskribon rekte de la RNA-ŝablono, kaj la inversa transskriba paŝo povas esti ripetita plurfoje por generi pli da cDNA-ŝablonoj.

· RevTaq RT-PCR DNA-polimerazo permesas "nul-paŝan" RT-PCR (neniu izoterma inversa transskriba paŝo), ĉar en la cikla PCR-etenda paŝo, inversa transskribo kaj DNA-plifortigo okazas samtempe.Tio ankaŭ antaŭenigas la inversan transskriban reagon ĉe altaj temperaturoj, tiel minimumigante la problemojn renkontitajn en fandado de la forta sekundara strukturo en RNA ĉe altaj temperaturoj.

· Pro la aptamer-bazita varma-komenca formulo, RevTaq RT-PCR DNA-polimerazo produktos pli bonajn rezultojn kiam la kalcia kaj etendaĵo temperaturo estas pli alta ol 57 °C.

· Ĉar la enzimo estas varmorezista, oni rekomendas desegni enkondukojn kaj sondilojn kun tre altaj fandpunktoj (>60°C).

· Oni rekomendas optimumigi la temperaturon de la kalcia/etenda paŝo tra temperaturgradiento dum la procezo de aranĝo de la reago.

· Ju pli alta la temperaturo, des pli alta la specifeco de PCR.La inversa transskriba ciklo estas kutime farita ĉe pli alta temperaturo ol la PCR-ciklo, ĉar DNA Primer:RNA Template hibridiĝo kutime havas pli altan frostopunkton ol DNA Primer:cDNA Template duplekso.

· RevTaq RT-PCR DNA-polimerazo estas genetike realigita kaj optimumigita, kaj la amplikongrandeco estas inter 60-300 bp.

RevTaq RT-PCR DNA-polimerazo-detekta limo atingas 4 kopiojn/

La optimumigita reagsistemo (la establado de altaj frostopunktoj enkondukoj) estas montrita en la figuro.RevTaq RT-PCR DNA-polimerazo-movita RT-PCR montras pli bonan sentemon ol TaqPath 1-paŝa RT-qPCR majstra miksaĵo, kaj pli malaltan detekto Sample diluogradiento.

Pli da avantaĝoj:

Rapida ekfunkcio → La komenca termika denatura paŝo povas esti preterlasita.

Varm-komenca aptamera formulo → Provizu 100%-enziman aktivecon tuj kaj malhelpi nespecifan plifortigon ĉe malaltaj temperaturoj (<57°C).

Interrompa funkcio → La RNA-ekstraktadpaŝo estas preterlasita, ĉar RevTaq RT-PCR DNA-polimerazo ankaŭ povas prilabori krudajn reagprovaĵojn.Ĝi povas tuj detrui la ĉelmembranojn de eŭkariotoj, bakterioj kaj virusoj en varma RT-PCR-ciklo.

IVD-nivelo de krudmaterialo → altkvalitaj normoj kaj ekstreme konkurencivaj prezoj