• facebook
  • linkedin
  • youtube

Konsiloj por Plibonigi Gluan Reakiron

1. Pliigu la specimenan ŝarĝon dum elektroforezo.

2. Uzu freŝe preparitan elektroforezan bufron.

3. Dum tranĉado de gluo, provu tranĉi nur la gluon per strioj por redukti la volumon de gluaĵo: ne bezonas gluon kun malmultaj celoj, alie ĝi influos la reakiron.

4. Post fandi du aŭ pli da pecoj da gluo, uzu tubon kiom ajn granda estas la volumeno kaj translokigu ĝin al la sama kolumno.

5. La solvo aldonita en la suno povas esti iom pli, kio estas pli favora al la ligado de DNA al la membrano, sed ĝenerale ne superas 750ul.

6. La ŝlosilo al ĝela reakiro estas ligi DNA al la kolumno per la salokoncentriĝo, acideco (ŝarĝo) kaj hidrofobeco de la solvo en la kolumno.Tial, se la pH de la elektroforezbufro estas tro alta, 10ul (pH 5.0, 3mol/L NaAC) povas esti aldonitaj al la suno;por pli bone kapti DNA-molekulojn sur la membrano, 30% izopropanolo povas esti aldonita por varmigi en la likvaĵon post dissolvo de la gluo.

7. Antaŭ ol aldoni la eluilon, lasu la kolumnon ĉe ĉambra temperaturo dum kelkaj minutoj (ĉirkaŭ 10 minutoj) por plene vaporigi la etanolon.

8. Fine, aldonu malpli da eluento por minimumigi la reakiran volumon.Ĝenerale, 30-50μl eluo estas uzata por eluo (ne tro malmulte, alie ĝi ne povos malsekigi la membranon, kio ne favoras al eluiĝo);la elivaj gutetoj estas en la centro de la membrano, por plene eligi la DNA ligitan al la membrano.

9. Post aldoni la eluentaĵon, ĝi povas esti eluzita en akvobanon de 55 gradoj dum 5 minutoj aŭ metita en akvobanon de 50 gradoj dum pli ol 10 minutoj, aŭ sigelita per parafilmo je 4 gradoj dum la nokto, kaj tiam centrifugata por reakiro la sekvan tagon, la efiko estas bona.

10.Aldonu la centrifugan eluiton reen al la adsorba kolumno kaj centrifugu denove.

bildo8

Detalaj metodoj kaj proceduroj por PCR-produkta reakiro

1. Ordinara kaŭĉuko reciklado

Se vi volas reakiri la gluon, plej bone estas uzi ilaron, kiu estas oportuna kaj havas iomete pli altan reakiron.Se vi vere bezonas reakiri ĝin permane, vi povas aldoni 3 fojojn la volumenon de TE post tranĉado de la gluo.Post fandado en akvobano, fenolo, fenolo/kloroformo estas eltirataj pure, kaj etanolo estas precipitata.Jen ĝi.

2. DNA-reakiro de malaltaj frostopunktoj ĝeloj

Purigado de DNA-Fragmentoj Aldonu TE (10 mmol/l Tris-HCl pH8,0, 0,1 mmol/l EDTA) egala al la volumeno de la ĝelo, kaj metu en akvobanon de 65 °C dum 5 minutoj por tute solvi la ĝelon.

Post kiam ĝi estis alportita al ĉambra temperaturo, egala kvanto de fenolo (saturita kun TE, TE estis sigelita en la supra tavolo, kaj la malsupra tavolo de fenolo estis forigita) estis aldonita, kaj la miksaĵo estis milde miksita (neniu miksado necesa), kaj centrifugata je 12,000 rpm dum 3 minutoj.Ripeti 1-2 fojojn.

Prenu la supernatante, aldonu 0,1 volumon de 3mol/L natria acetato (pH 5,2) kaj 2,5 fojojn volumeno de absoluta etanolo por efektivigi etanolan precipitadon.Solvu la purigitan DNA kun taŭga kvanto de TE, mezuru la enhavon kaj preparu por uzo (ĝi povas esti uzata por analizo de cela gena strukturo, enketpreparo ktp.).

3. PCR-reakiro kun bona plifortiga specifeco

Se la specifeco de PCR-plifortigo estas bona, ĝi estas nur simpla purigo kaj reakiro de la PCR-produkto.Vi povas aldoni 50ug/ml proteinazon K al la PCR-produkto, 37 gradojn dum 1 horo, ĉerpi unufoje per fenolo/kloroformo, ĉerpi unufoje kun kloroformo kaj aldoni 0,1 volumon de la supernatante.La natria acetato estis reakirita per precipitaĵo kun 2.5 volumoj da absoluta etanolo.

Rilataj produktoj:

https://www.foreivd.com/pcr-purification-kit-2-product/

https://www.foreivd.com/blood-superdirecttm-pcr-kit-edta-product/


Afiŝtempo: Sep-24-2022