Superrigardo
Rapida identigo de transgenaj plantoj
Teksto/Tong Yucheng
Eksperimenta operacio/Han Ying
Redaktoro/Wen Youjun
Vortoj/1600+
Sugestita legotempo/8-10 minutoj
Rapida identigo de transgenaj plantoj
Kiel novulo en la laboratorio, ne estas bona laboro eltiri pozitivajn plantojn el aro da plantoj kun malalta konvertiĝo.Unue, DNA devas esti eltirita de granda nombro da provaĵoj unu post alia, kaj tiam la fremdaj genoj estos detektitaj per PCR.Tamen, la rezultoj ofte estas malplenaj kaj bendoj kun kelkaj eroj foje, sed estas maleble determini ĉu ekzistas sopiritaj detektoj aŭ malveraj detektoj..Ĉu estas tre senpova alfronti tian eksperimentan procezon kaj rezultojn?Ne maltrankviliĝu, frato instruas vin kiel facile kaj precize forigi transgenajn pozitivajn plantojn.
Paŝo 1: Dezajnu detektajn enkondukojn
Determinu la endogenan genon kaj eksogenan genon por esti detektitaj laŭ la provaĵo, kaj elektu reprezentan 100-500bp-sekvencon en la geno por enkonduka dezajno.Bonaj enkondukoj povas certigi la precizecon de la detektrezultoj kaj mallongigi la detekttempon (vidu la apendicon por ofte uzataj detektkomencoj).
Notu:
La lastatempe dezajnitaj enkondukoj bezonas optimumigi la reagkondiĉojn kaj kontroli la precizecon, precizecon kaj detektan limon de la detekto antaŭ ol fari grandskalan detekton.
Paŝo 2:Disvolvi eksperimentan protokolon
Pozitiva kontrolo: Uzu la purigitan DNA enhavantan la celfragmenton kiel ŝablonon por determini ĉu la PCR-reaga sistemo kaj kondiĉoj estas normalaj.
Negativa/malplena kontrolo: Uzu DNA-ŝablonon aŭ ddH2O kiu ne enhavas la celfragmenton kiel ŝablonon por detekti ĉu ekzistas fonto de poluado en la PCR-sistemo.
Interna referenckontrolo: uzu la enkondukan/enketkombinaĵon de la endogena geno de la provaĵo por esti testita por taksi ĉu la ŝablono povas esti detektita per PCR.
Notu:
Pozitivaj, negativaj/malplenaj kontroloj kaj internaj kontrolaj kontroloj devas esti fiksitaj por ĉiu testo por taksi la validecon de la eksperimentaj rezultoj.
Paŝo 3: Eksperimenta preparado
Antaŭ uzo, observu ĉu la solvo estas egale miksita.Se troviĝas precipitaĵo, ĝi devas esti solvita kaj miksita laŭ la instrukcioj antaŭ uzo.2×PCR-miksaĵo devas esti pipetita kaj miksita plurfoje per mikropipeto antaŭ uzo por eviti malebenan jondistribuon.
Notu:
Elprenu la instrukciojn kaj legu ilin atente, kaj faru preparojn antaŭ la eksperimento strikte konforme al la instrukcioj.
Paŝo 4: Preparu PCR-reagan sistemon
Laŭ la eksperimenta protokolo, miksu la enkondukojn, H2O, 2×PCR miksas, centrifugu kaj distribuu ilin al ĉiu reagtubo.
Notu:
Por grandskala aŭ longdaŭra testado, oni rekomendas uzi PCR-reagan sistemon enhavantan UNG-enzimon, kiu efike povas eviti aerosolan poluadon kaŭzitan de PCR-produktoj.
Paŝo 5: Aldonu reagŝablonon
Uzante Rektan PCR-teknologion, ne necesas teda procezo de purigado de nuklea acido.La specimena ŝablono povas esti preta ene de 10 minutoj kaj aldonita al la responda PCR-reaga sistemo.
Notu:
La metodo Lysis havas pli bonan detektan efikon, kaj la akirita produkto povas esti uzata por multoblaj detektaj reagoj.
5.1: Rekta PCR de folioj
Laŭ la grandeco de la bildo en la manlibro, tranĉu la folian histon kun diametro de 2-3mm kaj metu ĝin en la PCR-reagan sistemon.
Noto: Certigu, ke la foliofragmentoj estas tute mergitaj en la PCR-reaga solvo, kaj ne aldonu troan folian histon.
5.2: Folia lizo-metodo
Tranĉu la folian histon kun diametro de 5-7 mm kaj metu ĝin en centrifugilon.Se vi elektas maturajn foliojn, bonvolu eviti uzi la histojn de la ĉefa vejno de la folio.Pipetu 50ul Buffer P1-liziton en centrifugan tubon por certigi, ke la lisato povas tute mergi la folian histon, metu ĝin en termociklilon aŭ metalan banon, kaj lizi je 95 °C dum 5-10 minutoj.
Aldonu 50ul Buffer P2-neŭtraligan solvon kaj miksu bone.La rezulta lisato povas esti uzata kiel ŝablono kaj aldonita al la PCR-reaga sistemo.
Noto: La kvanto de ŝablono devas esti inter 5-10% de la PCR-sistemo, kaj ne devus superi 20% (ekzemple, en 20μl PCR-sistemo, aldonu 1-2μl da liza bufro, ne pli ol 4μl).
Paŝo 6: PCR-Reago
Post centrifugado de la PCR-reaga tubo, metu ilin en PCR-instrumenton por plifortigo.
Notu:
La reago uzas ne-purigitan ŝablonon por plifortigo, do la nombro da plifortigaj cikloj estas 5-10 pli da cikloj ol kiam oni uzas purigitan DNA-ŝablonon.
Paŝo 7: Elektroforez-detekto kaj rezulta analizo
M:100bp DNA-Ŝtupetaro
1\4: Purigita DNA-metodo
2\5: Rekta PCR-metodo
3\6: Malplena kontrolo
Kontrolo de kvalito:
La testrezultoj de la diversaj kontroloj fiksitaj en la eksperimento devas plenumi la sekvajn kondiĉojn.Alie, la kaŭzo de la problemo devus esti analizita, kaj la testo devus esti farita denove post kiam la problemo estas forigita.
Tabelo 1. Normalaj testrezultoj de diversaj kontrolgrupoj
*Kiam la plasmido estas uzata kiel pozitiva kontrolo, la endogena gentestrezulto povas esti negativa
Rezulta juĝo:
R. La testrezulto de la endogena geno de la specimeno estas negativa, indikante, ke la DNA taŭga por ordinara PCR-detekto ne povas esti ĉerpita el la specimeno aŭ la ĉerpita DNA enhavas PCR-reagajn inhibilojn, kaj la DNA devas esti eltirita denove.
B. La testrezulto de la endogena geno de la specimeno estas pozitiva, kaj la testrezulto de la eksogena geno estas negativa, indikante, ke la DNA taŭga por ordinara PCR-detekto estas ĉerpita el la specimeno, kaj oni povas juĝi, ke la XXX-geno ne estas detektita en la specimeno.
C. La testrezulto de la endogena geno de la specimeno estas pozitiva, kaj la testrezulto de la eksogena geno estas pozitiva, indikante, ke la DNA taŭga por ordinara PCR-detekto estis ĉerpita el la specimeno, kaj la specimena DNA enhavas la XXX-genon.Konfirmaj eksperimentoj povas esti plue faritaj.
Paŝo 8: Dezajnu detektajn enkondukojn
Post la eksperimento, uzu 2% natria hipoklorita solvo kaj 70% etanola solvo por viŝi la eksperimentan areon por malhelpi median poluon.
Apendico
Tablo 2. Ofte uzataj enkondukoj por ĝenerala PCR-detekto de genetike modifitaj plantoj
Referenca dokumento:
SN/T 1202-2010, Kvalita PCR-detekta metodo por genetike modifitaj plantaj ingrediencoj en manĝaĵo.
Ministerio pri Agrikulturo Anonco 1485-5-2010, Testado de la ingrediencoj de genetike modifitaj plantoj kaj iliaj produktoj-rizo M12 kaj ĝiaj derivaĵoj.
Afiŝtempo: Jun-09-2021
