COVID-19 estas infekta malsano kaŭzita de Severa Akuta Spira Sindromo Koronavirus-Tipo 2. Kiam persono estas infektita, la plej oftaj simptomoj inkluzivas febron, tuson kaj spirmankon.
La specimenoj uzitaj por testado povas esti kolektitaj per nazofaringaj swaboj aŭ orofaringaj swaboj.
Kio estas PCR?
La norma metodo de koronavirus-detekto estas polimeraza ĉena reago, PCR.Ĉi tio estas metodo vaste uzata en molekula biologio.Ĝi povas rapide kopii milionojn al miliardoj da specifaj DNA-fragmentoj.
La nova koronavirus enhavas tre longan unufadenan RNA-genaron.Por detekti tiujn virusojn per PCR, RNA-molekuloj devas esti konvertitaj en siajn komplementajn DNA-sekvencojn per inversa transkriptazo, kaj tiam la lastatempe sintezita DNA povas esti plifortigita per normaj PCR-proceduroj, kiu estas ofte konata kiel RT-PCR.
RT-PCR-procezo
RNA-eltiro
Por plenumi ĉi tiun metodon, virusa RNA devus esence esti eltirita.Diversaj RNA-purigaj ilaroj povas esti uzataj por oportuna, rapida kaj efika apartigo.
Por ĉerpi virusan RNA uzante komercan ilaron, unue aldonu la specimenon al mikrocentrifuga tubo kaj tiam miksu ĝin kun la liza bufro.Tiu bufro estas tre denaturata kaj kutime konsistas el fenolo kaj guanidinizotiocianato.Krome, RNase-inhibitoroj ĉeestas kutime en la lizobufro por certigi izolitecon de sendifekta virusRNA.
Post aldoni la lizbufferon, vortigu la miksan tubon per pulso kaj kovu ĉe ĉambra temperaturo.La viruso tiam estas lizita sub tre denaturaj kondiĉoj disponigitaj per la lizbufro.
Post kiam la provaĵo estas lizita, centrifugila tubo estas uzata por la puriga proceduro.La provaĵo estas ŝarĝita en la centrifugiltubon kaj tiam centrifugata.
Ĉi tiu proceduro estas solidfaza ekstrakta metodo en kiu la senmova fazo konsistas el silika ĝela matrico.
Sub optimumaj salo kaj pH-kondiĉoj, RNA-molekuloj ligas al la silicoksidmembrano.
Samtempe, proteinoj kaj aliaj poluaĵoj estas forigitaj.
Post centrifugado, metu la centrifugan tubon en puran kolekton, forĵetu la filtriton, kaj poste aldonu lavbufferon.
Metu la tubon en la centrifugilon denove por devigi la lavbufferon tra la membrano.Tio forigos ĉiujn ceterajn malpuraĵojn de la membrano, lasante nur la RNA ligitan al la silika ĝelo.
Post kiam la specimeno estas lavita, metu la tubon en puran mikrocentrifugan tubon kaj aldonu la elivan bufron.
Ĝi tiam estas centrifugite por devigi la eluobufron tra la membrano.La eluobufro forigas virusan RNA de la spinkolono kaj akiras purigitan RNA liberan de proteinoj, inhibitoroj, kaj aliaj poluaĵoj.
PAŜO 2
Miksa koncentriĝo
Post eltiro de la virusa RNA, la sekva paŝo estas prepari la reagmiksaĵon por PCR-plifortigo.En ĉi tiu paŝo, koncentriĝo estas uzata.Ĉi tiu koncentrita solvaĵo estas premiksita koncentrita solvaĵo konsistanta el premiksaĵo, inversa transkriptazo, nukleotidoj, antaŭa enkonduko, inversa enkonduko, TaqMan-enketo kaj DNA-polimerazo.
Fine, por kompletigi ĉi tiun reakcian miksaĵon, la RNA-ŝablono estas aldonita.La tuboj estas miksitaj per pulsvortico, kaj tiam la reagmiksaĵo estas ŝarĝita en la PCR-platon.La PCR-plato kutime enhavas 96 putojn kaj povas analizi plurajn specimenojn samtempe.
PAŜO 3
PCR-plifortigo
Poste, metu la teleron en la PCR-maŝinon, kiu estas esence termika ciklo.
Realtempa RT-PCR estas uzata por detekti la novan koronaviruson de 2019 plifortigante la celsekvencon en la geno RdrRP, E-geno kaj N-geno.La elekto de celgeno dependas de la enkonduko kaj enketsekvenco.
La unua paŝo de RT-PCR estas inversa transskribo.La unua fadeno de komplementa DNA estas sintezita, kiu estas iniciatita per la PCR-inversa enkonduko, kiu ligas al la komplementa parto de la virusRNA-genaro.Tiam inversa transkriptazo aldonas DNA-nukleotidojn al la 3′fino de la enkonduko por sintezi DNA komplementan al la virusRNA.La temperaturo kaj tempodaŭro de tiu paŝo dependas de la enkondukoj, cela RNA, kaj inversa transkriptazo uzita.
Venonta, komenca denatura paŝo estas aplikita, kiu rezultigas la denaturigon de la RNA-DNA hibrido.Ĉi tiu paŝo estas necesa por aktivigi la DNA-polimerazon.En la sama tempo, inversa transskribazo estas inaktivigita.
PCR konsistas el serio de termikaj cikloj.Ĉiu ciklo konsistas el denaturado, kalciado kaj etendaĵo-ŝtupoj.
La denaturigpaŝo implikas varmigi la reagkameron al 95 celsiusgradoj kaj uzi ĝin por denaturigo de la duoble-senhelpa DNA-ŝablono.
En la venonta paŝo, la reagtemperaturo estas reduktita al 58 celsiusgradoj, permesante al la antaŭa enkonduko kalumi al la komplementa parto de sia unu-fadena DNA-ŝablono.La kalcia temperaturo rekte dependas de la longo kaj konsisto de la enkonduko.
En la etendaĵopaŝo, la DNA-polimerazo sintezas novan DNA-fadenon kiu estas komplementa al la DNA-ŝablofadeno.Aldonante liberajn nukleojn komplementajn al la ŝablono en la 5′al 3′direkto de la reagmiksaĵo.La temperaturo de ĉi tiu paŝo dependas de la DNA-polimerazo uzata.
Post la unua ciklo, duoble-fadena DNA-celo estas akirita.
Poste, eniru la duan ciklon.La duoble-fadena DNA estas denaturigita por produkti du unu-fadenajn DNA-molekulojn.
En la venonta paŝo, la reagtemperaturo estas malaltigita, la enkondukoj estas kalzitaj al ĉiu unu-fadena DNA-ŝablono, kaj la Taq-man-enketo estas kalzita al la komplementa parto de la cela DNA.
La TaqMan-enketo konsistas el fluoroforo kovalente ligita al la 5′fino de la oligonucleotid-enketo.Se ekscitita per la lumfonto de la ciklilo, la fluoroforo elsendas fluoreskecon.Krome, la sondilo estas kunmetita de estingilo ĉe la 3′fino.La proksimeco de la raportistogeno al la estingilo malhelpas la detekton de fluoreskeco.
En la etendpaŝo, la DNA-polimerazo sintezas novan fadenon.Kiam la polimerazo atingas la TaqMan-enketon, ĝia endogena 5′nuclease-agado fendas la enketon, apartigante la tinkturfarbon de la estingilo.
Kun ĉiu ciklo de PCR, pli da tinkturfarbmolekuloj estas liberigitaj, rezultigante pliiĝon en fluoreskecintenseco proporcia al la nombro da amplikonoj sintezitaj.
Ĉi tiu metodo permesas taksi la nombron de antaŭfiksita sekvenco ĉeestanta en la provaĵo.La nombro da duoble-senhelpaj DNA-fragmentoj duobliĝas en ĉiu ciklo.Tial, PCR povas esti uzita por analizi tre malgrandajn provaĵojn.
Por mezuri fluoreska signalo, volframa halogena lampo, ekscita filtrilo, reflektoro, lenso, emisiofiltrilo kaj ŝargo kunligita aparato-uzo CCD-fotilo.
PAŜO 4 Detekti
Por mezuri fluoreska signalo, volframa halogena lampo, ekscita filtrilo, reflektoro, lenso, emisiofiltrilo kaj ŝargo kunligita aparato-uzo CCD-fotilo.
La filtrita lumo de la lampo estas reflektita per la reflektoro, pasas tra la kondensillenso, kaj estas enfokusigita al la centro de ĉiu truo.Tiam la fluoreskeco elsendita de la truo estas reflektita de la spegulo, pasas tra la emisiofiltrilo, kaj estas detektita per la CCD-fotilo.En ĉiu PCR-ciklo, la mem-ekscita fluoroforlumo povas esti detektita per la CCD.
Ĝi konvertas la kaptitan lumon en ciferecajn datumojn.Ĉi tiu metodo estas nomita realtempa PCR, kaj ĝi permesas realtempan monitoradon de la progreso de la PCR-reago.
Afiŝtempo: Jul-19-2021
