PCR estas la plej vaste uzata nuklea acida plifortiga teknologio kaj estas vaste uzata pro sia sentemo kaj specifeco.Tamen, PCR postulas ripetan termikan denaturadon kaj ne povas forigi la limigojn de fidado de instrumentoj kaj ekipaĵo, kiu limigas ĝian aplikon en klinika kamptestado.
Ekde la fruaj 1990-aj jaroj, multaj laboratorioj komencis evoluigi konstantan temperaturan plifortigan teknologion kiu ne postulas termikan denaturon.Nun ili evoluigis buklo-mediatan izoterman plifortigan teknologion, fadenanstataŭan izoterman plifortigan teknologion, ruliĝantan izoterman plifortigan teknologion kaj nukleacidan sinsekvan dependecon.Izoterma plifortiga teknologio kaj aliaj teknologioj.
Loop-mediata izoterma plifortigo
La plifortiga principo baziĝas sur la fakto, ke DNA estas en dinamika ekvilibra stato je ĉirkaŭ 65 °C.Kiam iu enkonduko estas baz-parigita kaj etendita al la komplementa parto de duoble-fadena DNA, la alia fadeno disiĝos kaj iĝos unu-fadena.
Ĉe tiu temperaturo, DNA uzas 4 specifajn enkondukojn por fidi je faden-delokiĝo DNA-polimerazo por igi la sintezon de faden-delokiĝo DNA mem-cirkuli ade.
Unue determinu la 6 specifajn regionojn F3, F2, F1, B1, B2, B3 sur la celgeno, kaj tiam dizajnu 4 enkondukojn bazitajn sur ĉi tiuj 6 specifaj regionoj (kiel montrite en la figuro malsupre):
La antaŭa interna enkonduko (FIP) estas kunmetita de F1c kaj F2.
La malantaŭa interna enkonduko (BIP) estas kunmetita de B1c kaj B2, kaj TTTT estas utiligita kiel interspacilo en la mezo.
La eksteraj enkondukoj F3 kaj B3 estas respektive kunmetitaj de F3 kaj B3-regionoj sur la celgeno.
En la LAMP-reagsistemo, la koncentriĝo de la interna enkonduko estas plurajn fojojn tiu de la ekstera enkonduko.La interna enkonduko unue estas kombinita kun la ŝablonfadeno por sintezi komplementan fadenon por formi DNA-duoblan fadenon.Poste, la ekstera enkonduko estas kombinita kun la ŝablonfadeno por formi DNA-duoblan fadenon.Sub la ago de BstDNA polimerazo, la komplementa fadeno sintezita per la interna enkonduko estas liberigita.Post serio de reagoj, la komplementa fadeno finfine formas ununuran DNA-fadenon kun halta strukturo.
La haltera strukturo DNA-unuopa fadeno mem estas utiligita kiel ŝablono por ade formi transiran tig-buklan strukturon DNA kun malferma fino.La internaj kaj eksteraj enkondukoj gvidas la transiran tig-buklan strukturon DNA por ade sperti fadendelokiĝon kaj etendaĵreagojn, kaj finfine formi multoblajn tig-buklajn strukturojn kun malsamaj longoj.DNA-miksaĵo.
Avantaĝoj kaj malavantaĝoj de buklo-mediaciita izoterma plifortigo
Avantaĝoj de LAMPO:
(1) Alta plifortiga efikeco, kiu povas efike plifortigi 1-10 kopiojn de la cela geno ene de 1 h, kaj la plifortiga efikeco estas 10-100 fojojn tiu de ordinara PCR.
(2) La reagotempo estas mallonga, la specifeco estas forta, kaj neniu speciala ekipaĵo estas bezonata.
Mankoj de LAMPO:
(1) La postuloj por enkondukoj estas aparte altaj.
(2) La plifortigita produkto ne povas esti uzata por klonado kaj sekvencado, sed nur por juĝo.
(3) Pro ĝia forta sentemo, estas facile formi aerosolojn, kaŭzante falsajn pozitivojn kaj influante la testrezultojn.
Strand movo plifortigo
Strand-delokiĝoplifortigo (SDA) estas en vitro izoterma DNA-plifortigo tekniko bazita sur enzimeca reago unue proponita fare de amerika akademiulo Walker en 1992.
La baza sistemo de SDA inkludas restriktendonukleazon, DNA-polimerazon kun fadendelokiga agado, du parojn de enkondukoj, dNTPoj, kaj kalcio kaj magneziojonoj kaj bufrosistemoj.
La principo de fadendelokiĝoplifortigo estas bazita sur la kemie modifita restrikta endonucleaza rekonsekvenco ĉe ambaŭ finoj de la cela DNA.La endonuclease malfermas la interspacon en la fadeno DNA ĉe sia rekonejo, kaj la DNA-polimerazo etendas la interspacon 3′ Fino kaj anstataŭigas la venontan DNA-fadenon.
La anstataŭigitaj ununuraj fadenoj de DNA povas esti kombinitaj kun enkondukoj kaj etenditaj en duoblajn fadenojn per DNA-polimerazo.Tiu procezo estas ripetita ade, tiel ke la celsekvenco estas efike plifortigita.
Avantaĝoj kaj malavantaĝoj de fadena delokiĝo-amplifiga teknologio
Avantaĝoj de SDA:
La efikeco de plifortigo estas alta, la tempo de reago estas mallonga, la specifeco estas forta, kaj neniu speciala ekipaĵo estas bezonata.
Mankoj de SDA:
La produktoj ne estas unuformaj, kaj iuj unu-fadenaj kaj duoble-fadenaj produktoj ĉiam estas produktitaj en la SDA-ciklo, kaj vosto neeviteble okazos kiam detektita per elektroforezo.
Rolling cirklo plifortigo
Plifortigo de ruliĝanta cirklo (RCA) estas proponita uzante la metodon de kopiado de DNA de patogenaj organismoj per ruliĝanta cirklo.Ĝi rilatas al la uzo de unu-strand cirkla DNA kiel ŝablono ĉe konstanta temperaturo, kaj speciala DNA polimerazo (kiel Phi29) ) Sub la ago de ruliĝanta cirklo DNA sintezo por atingi la plifortigon de la cela geno.
RCA povas esti dividita en linearan plifortigon kaj eksponenta plifortigon.La efikeco de lineara RCA povas atingi 105fojojn, kaj la efikeco de eksponenta RCA povas atingi 109fojojn.
Simpla distingo, kiel montrite en la figuro malsupre, linia plifortigo a nur uzas 1 enkondukon, eksponenta plifortigo b havas 2 enkondukojn.
Lineara RCA ankaŭ estas nomita ununura enkonduko RCA.Enkonduko ligas al cirkla DNA kaj estas etendita per la ago de DNA-polimerazo.La produkto estas linia ununura fadeno kun granda nombro da ripetemaj sekvencoj miloj da fojoj la longo de ununura buklo.
Ĉar la produkto de lineara RCA ĉiam estas ligita al la komenca enkonduko, la facila fiksado de la signalo estas grava avantaĝo.
Eksponenta RCA, ankaŭ konata kiel Hyper branched amplification HRCA (Hyper branched RCA), en eksponenta RCA, unu enkonduko plifortigas la RCA-produkton, la dua enkonduko hibridiĝas kun la RCA-produkto kaj etendiĝas, kaj la anstataŭaĵo jam estas ligita al la RCA-produkto La laŭfluaj enkondukoj etendas la fadenon, kaj ripetas etendon kaj anstataŭaĵon por produkti dendritan produkton RCA.
La avantaĝoj kaj malavantaĝoj de ruliĝanta cirklo-nukleacida plifortigo
Avantaĝoj de RCA:
Alta sentemo, bona specifeco kaj facila operacio.
Mankoj de RCA:
Fonaj problemoj dum signala detekto.Dum la RCA-reago, la necirkulata pendseruro enketo kaj la ŝablono DNA aŭ RNA de la nebindita enketo povas generi kelkajn fonsignalojn.
Nucleicacid sekvenc-bazita plifortigo
Nukleacida sekvenc-bazita plifortigo (NASBA) estas nova teknologio evoluigita surbaze de PCR.Ĝi estas kontinua kaj izoterma nuklea acida plifortigo gvidita per paro de enkondukoj kun T7-reklamantsekvenco.La teknologio povas plifortigi la ŝablonon RNA je proksimume 109 fojojn en proksimume 2 horoj, kio estas 1000 fojojn pli alta ol la konvencia PCR-metodo kaj ne postulas specialan ekipaĵon.
Ĉi tiu teknologio estis uzata por rapida diagnozo de malsanoj tuj kiam ĝi aperis, kaj multaj kompanioj nuntempe uzas ĉi tiun metodon en RNA-detektkompletoj.
Kvankam RNA-plifortigo ankaŭ povas uzi inversan transskriban PCR-teknologion, NASBA havas siajn proprajn avantaĝojn: ĝi povas esti efektivigita sub relative konstantaj temperaturkondiĉoj, kaj ĝi estas pli stabila kaj preciza ol tradicia PCR-teknologio.
La reago estas je 41 celsiusgradoj kaj postulas AMV (birda mieloblastozoviruso) inversan transkriptazon, RNase H, T7 RNA polimerazon kaj paron de enkondukoj por kompletigi.
La procezo ĉefe inkluzivas:
La antaŭa enkonduko enhavas la komplementan sekvencon de la T7-reklamanto.Dum la reago, la antaŭa enkonduko ligas al la RNA-fadeno kaj estas katalizita per la AMV-enzimo por formi DNA-RNA duoblan fadenon.
RNase H digestas la RNA en la hibrida duoble-fadeno kaj retenas la unu-fadenan DNA.
Sub la ago de la inversa enkonduko kaj la AMV-enzimo, DNA-duobla fadeno enhavanta la T7-reklamantsekvencon estas formita.
Sub la ago de T7 RNA-polimerazo, la transskriba procezo estas finita kaj granda kvanto de cela RNA estas produktita.
Avantaĝoj de NASBA:
(1) Ĝia enkonduko havas T7-reklamansekvencon, sed la fremda duoble-fadena DNA havas neniun T7-reklamantan sekvencon kaj ne povas esti plifortigita, do ĉi tiu teknologio havas altan specifecon kaj sentemon.
(2) NASBA rekte korpigas la inversan transskriban procezon en la plifortiga reago, mallongigante la reagtempon.
Malavantaĝoj de NASBA:
(1) La reagaj komponantoj estas pli komplikaj.
(2) Tri specoj de enzimoj estas postulataj por plialtigi la reagokoston.
Afiŝtempo: Aŭg-06-2021
