• facebook
  • linkedin
  • youtube

1. Detekti la absorbadon de RNA-solvo

Absorbance ĉe 280, 320, 230, kaj 260 nm reprezentas la valorojn de nuklea acido, fono (solvomalklareco), salkoncentriĝo, kaj organika materio kiel ekzemple proteino, respektive.Ĝenerale nur rigardu OD260/OD280 (Ratio, R).Kiam 1.8~2.0, ni opinias, ke la poluado de proteino aŭ alia organika materio en RNA povas esti tolerita, sed oni devas rimarki, ke kiam Tris estas uzata kiel bufro por detekti la absorbadon, la R-valoro povas esti pli granda ol 2 (ĝenerale). ĝi devus esti <2.2).Kiam R<1.8, la poluado de proteino aŭ alia organika materio en la solvaĵo estas pli evidenta, kaj la sorto de la RNA povas esti determinita laŭ la bezonoj.Kiam R>2.2, ĝi signifas ke RNA estis hidroligita en ununuran nuklean acidon.
 
2.Elektroforetika ŝablono de RNA
Ĝenerale, denatura ĝelo estas uzata por RNA elektroforezo, sed se ĝi estas nur por detekti la kvaliton de RNA, denatura ĝelo ne estas necesa, kaj ordinara agarozoĝelo povas esti uzata.La celo de elektroforezo estas detekti la integrecon de 28S kaj 18S-grupoj kaj ilian rilatumon, aŭ la integrecon de mRNA-makulo.Ĝenerale, se la 28S kaj 18S-bendoj estas brilaj, klaraj kaj akraj (rilatante al la randoj de la bandoj estas klaraj), kaj la brileco de 28S estas pli ol duoble ol la de la 18S-bendo, ni konsideras la kvaliton de la RNA kiel estu bona.
Ĉi-supraj estas la du metodoj, kiujn ni kutime uzas, sed neniu el ĉi tiuj du metodoj povas klare diri al ni ĉu estas resta RNazo en la RNA-solvo.Se estas tre malgranda kvanto da RNase en la solvo, estas malfacile por ni detekti ĝin per la ĉi-supra metodo, sed la plej multaj el la postaj enzimecaj reagoj okazas je pli ol 37 gradoj kaj dum longa tempo.Tiamaniere, se estas tre malgranda kvanto da RNazo en la RNA-solvo, tiam estos tre taŭga medio kaj tempo por ludi ilian rolon en la postaj eksperimentoj, kaj kompreneble la eksperimento estos malvarma ĉi-momente.Malsupre ni enkondukas metodon kiu povas konfirmi ĉu ekzistas resta RNazo en la RNA-solvo.
 
3. Testo pri varmo konservado
Laŭ la specimena koncentriĝo, eltiru du 1000 ng RNA el la RNA-solvo kaj aldonu ĝin al 0,5 ml centrifugiltubo, kaj suplementu ĝin per pH 7,0 Tris-bufro ĝis totala volumeno de 10 ul, kaj poste sigelu la ĉapon de la tubo.Metu unu el ili en konstantan temperaturon akvobanon je 70 °C kaj tenu ĝin varma dum 1 h.La alia parto estis konservita en fridujo de -20 °C dum 1 horo.Kiam la tempo finiĝas, forigu la du specimenojn por elektroforezo.Post kiam la elektroforezo estas kompletigita, komparu la elektroforetikajn grupojn de la du.Se la bandoj de la du estas konsekvencaj aŭ ne havas signifan diferencon (kompreneble, iliaj bandoj ankaŭ plenumas la kondiĉojn en metodo 2), tio signifas, ke ekzistas neniu resta RNase-poluado en la RNA-solvo, kaj la kvalito de la RNA estas tre. bona.Male, se la specimeno kovita je 70 °C montras evidentan degeneron, ĝi indikas ke ekzistas RNase-poluado en la RNA-solvo.
 
2 Eksperimentaj metodoj kaj teknikoj por RNA-ekstraktado
La problemoj, kiujn ni ofte renkontas kiam ĉerpas RNA, estas: (1) RNA-rendimento estas malalta;(2) RNA havas gravan salpoluadon;(3) RNA havas gravan organikan solventan poluadon;(4) specimena degradado kaj aliaj problemoj
 
1. Ofte uzataj totalaj RNA-ekstraktaj reakciiloj
La guanidinizotiocianatmetodo kaj la Trizol-metodo estas la plej ofte uzitaj metodoj por la ekstraktado de totala RNA de bestaj histoj kaj bestaj ĉeloj.Ĝi estas precipe taŭga por malgrandaj specimenoj kaj histoj kiuj estas precipe malfacile eltiri, kiel ekzemple la eltiro de totala RNA de kuniklo haŭto kaj besta konektiva histo;krome, Trizol, kiel ĝeneraluzebla liza reakciilo, ankaŭ povas esti uzata por eltiro de plantaj histoj, bakterioj, fungoj kaj aliaj histoj.Por plantaj histoj enhavantaj polisakaridojn kaj polifenolojn, kiel camelia oleifera, tefolioj, kolzo, ktp., la CTAB-metodo ankaŭ povas esti uzata por ĉerpi totalan RNA.

Kiel konvencia metodo, la duobla-kolumna metodo ankaŭ estas tre populara pro sia normala temperaturoperacio, ne necesas aldoni RNazon, kaj sekurecon - neniu kloroformo, fenoloj kaj aliaj organikaj reakciiloj por eltiro.(rekomenditaj produktoj )

1
2

2. Eltiro de totala RNA el bestaj histoj
 
(1) Provu elekti freŝan histon, se ĝi ne estas freŝa (prefere ene de tri monatoj - 80 ℃ fridujo aŭ frostigita en likva nitrogeno. Tranĉante histon, ne tranĉu rekte ĉe ĉambra temperaturo, nepre Metu ĝin sur la glaciskatolo). , provu eviti ripetan frostiĝon kaj degelon.
(2) Uzu purajn tondilojn kaj pinĉilojn por tranĉi malgrandan pecon de histo, provu tranĉi la centran parton de la histo dum tranĉado de la specimeno, aŭ unue tranĉu la grandan pecon de histo de la mezo, kaj tiam tranĉu la specimenon ĉe la freŝa. inciza pozicio.La forigita histo devas esti plene dispecigita, metu la dispecigitan histon en EP-tubon sen RNazo, aldonu la lizaton, la dispecigita histo estu plene elmontrita al la lisato kaj preparu por homogeniĝo.

(3) Por normalaj histoj, elektu mungofab-grandajn histojn (30-60 mg) por homogenigo.Se la histoj enhavas grandan kvanton da proteino, graso aŭ densaj fibrecaj histoj kiel hepato, taŭge pliigu aŭ malpliigu la kvanton da tranĉitaj histoj (laŭvola) Elektu 10~20 mg).
(4) Se ĉerpas fiŝmuskolon, salikokviandon, meduzon kaj aliajn histojn kun alta akvoenhavo, la specimena volumo devus esti taŭge pliigita (rekomendita 100-200 mg).
(5) Se kondiĉoj permesas, la besta histo povas esti rekte ĉerpita post esti homogenigita per alt-pasa histo-homogeneizador, se ne ekzistas tia ekipaĵo.
(6) La RNA akirita post la fina eltiro devas esti metita sur la glaciujon tuj por redukti la degeneron de RNA.

3. Besta ĉelo RNA-eltiro

(1) Suspensiaj ĉeloj: centrifugu rekte kaj forĵetu la medion, lavu per sterila PBS 1-2 fojojn, poste suspendu per taŭga kvanto da PBS, kaj poste aldonu lizaton por lizo.Ne aldonu la lisaton rekte al la precipitaj ĉeloj post tute forĵeti la likvaĵon.Tio igos la histonpakaĵon liberigita post la lizitaj ĉeloj sur la ekstera tavolo aliĝi al la ekstero de la precipitaj ĉeloj, tiel limigante la kontakton de la ĉeloj ene de la buleto kun la lisato., rezultigante nekompletan ĉellizon kaj reduktitan RNA-rendimenton.

(2) Ĉeloj, kiuj estas duon-adheraj aŭ ne firme adheraj: Post forĵeti la medion, lavu per PBS 1-2 fojojn, tiam rekte sorbi taŭgan kvanton da PBS kaj blovu la kulturpladon per pipeto aŭ pafilo por forblovi la. ĉeloj, kaj transdoni ilin al RNA-liberaj ĉeloj.Aldonu la lisaton al la EP-tubo de la enzimo por eltiro.

(3) Adheraj ĉeloj: unue devas esti digestitaj per tripsino, poste kolektitaj en RNase-liberajn EP-tubojn, centrifugitaj por forigi la supernatanton, lavitaj 1-2 fojojn per PBS por forigi troan tripsinon, kaj resuspenditaj per taŭga kvanto da PBS Poste daŭrigu la eltiran paŝon.

4. Planta RNA-eltiro

Plantaj histoj estas riĉaj je fenolaj kunmetaĵoj, aŭ riĉaj je polisakaridoj, aŭ enhavas kelkajn neidentigitajn sekundarajn metabolitojn, aŭ havas altan agadon de RNazo.Tiuj substancoj estas malloze kombinitaj kun RNA post ĉellizo por formi nesolveblajn kompleksojn aŭ koloidajn precipitaĵojn, kiujn malfacilas forigi.Tial, kiam ni ĉerpas plantajn histojn, ni devas elekti ilaron por plantoj.La lisato en la ilaro povas efike solvi la problemojn de facila oksidado de polifenoloj kaj apartigo de polisakaridaj komponaĵoj kaj nukleaj acidoj.

(Por eltiro de RNA de polisakarida polifenola planto, rekomenditaj produktoj:

(1) La ŝelo, pulpo, semoj, folioj ktp de la planto devas esti plene muelitaj en pistujo.Dum la muelanta procezo, likva nitrogeno devas esti replenigita ĝustatempe por eviti fandi la specimenon.La grunda specimeno devas esti rapide aldonita al la lisato kaj skuita por eviti RNA-degeneron.

(2) Por fibro-riĉaj specimenoj kiel rizo kaj tritiko folioj, la kvanto de eltiro devus esti taŭge reduktita, alie la histo muelado kaj lizo ne estos kompletaj, rezultigante malaltan rendimenton de ĉerpita RNA.

(3) Por plantaj histoj kun alta akvoenhavo, kiel granata frukto, akvomelona frukto, persika frukto, ktp., la specimena grandeco devus esti taŭge pliigita (100-200 mg estas laŭvola).

(4) Plantaj histoj, kiel plantfolioj, rizomoj, malmolaj fruktoj kaj aliaj materialoj, estas ĝenerale rekomenditaj uzi likvan nitrogenon por ĝisfunde pistuji la ingrediencojn en pistujo, kaj poste daŭrigi la eltiran paŝon.Konvenciaj histohomogenigiloj eble ne estas efikaj en homogenigado de planthistoj, kaj estas ĝenerale ne rekomenditaj.

5. Antaŭzorgoj por RNA-eltiro

(1) Specimenoj de histo estu kiel eble plej freŝaj por eviti ripetan frostiĝon kaj degelon.

(2) La histo devas esti plene muelita dum eltiro, kaj la kvanto de histo ne estu tro malgranda, des malpli tro multe.

(3) Sufiĉa kovada tempo devus esti donita post aldonado de la lisato por plene lizi la specimenon.

(4) Kiam oni uzas la Trizol-metodon por eltiro, la principo de sorbado de la supernatante post tavoliĝo estas "preferas enspiri malpli ol enspiri pli", kaj ne devas ĉerpi al la meza tavolo, alie ĝi kaŭzos gravan genoman DNA-poluadon.

(5) Dum lavado, la lavlikvaĵo devas plene enfiltri ĉirkaŭ la tubmuro por certigi ĝisfundan lavadon.

(6) Por la kolumna eltira metodo, krom dekroĉi la kolumnon post lavado, la adsorba kolumno ankaŭ devas esti metita en ultra-puran benkon kaj blovita dum 5-10 minutoj por plene vaporigi la organikan solvilon al sekeco.

(7) Ĉe la lasta eluo de la kolumna metodo, post aldoni DEPC-akvon, ĝi devas esti kovata dum 3-5 minutoj, aŭ la DEPC-akvo devus esti varmigita al 60 °C anticipe por pliigi la elucian rendimenton.En la tradicia Trizol fendetaĵo kaj izopropanola precipita metodo, la fina RNA estas solvita en DEPC-akvo, do taŭga tempo devus esti donita por dissolvo, kaj la fundo de la centrifugila tubo devus esti kontinue blovita per pipetpinto.

3 Tĉi tie Kaŭzoj kaj solvoj por malalta RNA-koncentriĝo/malbona kvalito
 
1. La rendimento estas tro malalta
La ĉerpita specimeno estas tro malalta, la totala kvanto estas nesufiĉa, aŭ la ĉerpita specimeno estas tro multe kaj la lizo ne estas kompleta;la histo aŭ ĉeloj de taŭga kvalito estu uzataj por eltiro, la antaŭtraktado de la specimeno devas esti farita bone, kaj la lizo estu sufiĉa.
 
2. Genoma restaĵoj
Ĉe eltiro per Trizol-metodo, kiam la supernatante estas suĉita en la mezan tavolon post tavoliĝo, serioza genoma poluado estos kaŭzita;ekstra zorgo devas esti prenita dum tavoliĝo por eviti suĉi en la mezan tavolon.Se la kolumna metodo estas uzata por eltiro, ilaro enhavanta DNase I povas esti elektita por eltiro.La nuklea acido adsorbita sur la membrano estas rekte digestita kun DNase I, kiu povas multe redukti DNA-restaĵojn.
 
3. RNA-degenero
Ĝi povas esti la degenero de la ĉerpita specimeno mem, aŭ la degenero kaŭzita dum la eltira procezo;laŭeble, freŝaj specimenoj estu uzataj por RNA-ekstraktado, kaj la kolektitaj specimenoj estu konservitaj en likva nitrogeno aŭ -80 °C fridujo ĝustatempe, kaj ripeta frostigado kaj degelo estu evititaj.RNase/DNase-liberaj konsiletoj, centrifugiltuboj kaj aliaj materialoj devus esti uzitaj en la RNA-eltiradprocezo.La eltira procezo devus esti kiel eble plej rapida.La ĉerpita RNA devus esti metita sur glaciskatolo kaj stokita je -80 en tempo.Se la ĉerpita RNA devas esti detektita per ĝela elektroforezo, elektroforezo devus esti farita tuj post eltiro, kaj la elektroforezbufro devus esti anstataŭigita per nove preta.
 
4. Salo kaj organikaj solvaj restaĵoj
La eltiraj reakciiloj enhavas fenolon kaj guanidajn salojn, kaj la lavsolvo enhavas etanolon.Dum la ekstrakta procezo, la lisato ne estis tute sorbita kaj forĵetita, kaj la lavsolvo ne estis plene sekigita.Restaj saloj kaj organikaj solviloj estas damaĝaj al posta inversa transskribo kaj PCR.Malsamaj gradoj de inhibicio, do la hista lisato devas esti plene forigita dum la eltira procezo, kaj la lavado estu sufiĉa por ke la ĉirkaŭaj muroj de la tubo estu lavitaj.Krome, la tubo estas malplenigita kaj blovita estas necesa paŝo, kiu plu reduktos la restaĵon de organika materio.
 
Por pliaj informoj pri RNA-ekstraktado, bonvolu sekvi nian retejon:
www.foreivd.com por pliaj informoj.

7

Afiŝtempo: Dec-01-2022