• facebook
  • linkedin
  • youtube

Molekula diagnoza teknologio uzas molekulajn biologiajn metodojn por detekti la esprimon kaj strukturon de la genetika materialo de la homa korpo kaj diversaj patogenoj, por atingi la celon antaŭdiri kaj diagnozi malsanojn.

En la lastaj jaroj, kun la ĝisdatigo kaj ripeto de molekula diagnoza teknologio, la klinika apliko de molekula diagnozo fariĝis pli kaj pli ampleksa kaj profunda, kaj la molekula diagnoza merkato eniris en periodon de rapida disvolviĝo.

La aŭtoro resumas la komunajn molekulajn diagnozajn teknologiojn sur la merkato, kaj estas dividita en tri partojn: la unua parto enkondukas la PCR-teknologion, la dua parto enkondukas la nuklean acidan izoterman plifortigan teknologion, kaj la dua parto enkondukas la sinsekvan teknologion.

01

Parto I: PCR-Teknologio

PCR-teknologio

PCR (polimeraza ĉenreago) estas unu el la en vitro DNA-amplifigaj teknologioj, kun historio de pli ol 30 jaroj.

PCR-teknologio estis iniciatita en 1983 fare de Kary Mullis de Cetus, Usono.Mullis petis pri PCR-patento en 1985 kaj publikigis la unuan PCR-akademian artikolon pri Science en la sama jaro.Mullis gajnis la Nobelpremion pri Kemio en 1993.

Bazaj Principoj de PCR

PCR povas plifortigi celajn DNA-fragmentojn je pli ol unu miliono da fojoj.La principo estas ke sub la katalizo de DNA-polimerazo, la gepatra fadeno DNA estas utiligita kiel ŝablono, kaj specifa enkonduko estas utiligita kiel la deirpunkto por etendaĵo.Ĝi estas reproduktita en vitro tra ŝtupoj kiel ekzemple denaturigo, kalciado, kaj etendaĵo.La procezo de filinfadena DNA komplementa al la gepatra fadenŝablona DNA.

1

La norma PCR-procezo estas dividita en tri ŝtupojn:

1. Denaturado: Uzu altan temperaturon por apartigi DNA-duoblajn fadenojn.La hidrogenaj ligoj inter DNA-duoblaj fadenoj estas rompitaj ĉe altaj temperaturoj (93-98 °C).

2. Kolektado: Post kiam la duoble-fadena DNA estas apartigita, la temperaturo estas malaltigita tiel ke la enkonduko povas ligi al la unu-fadena DNA.

3. Etendaĵo: La DNA-polimerazo komencas sintezi komplementajn fadenojn laŭ la DNA-fadenoj de la enkondukoj ligitaj kiam la temperaturo estas malaltigita.Kiam la etendaĵo estas kompletigita, ciklo estas kompletigita, kaj la nombro da DNA-fragmentoj duobliĝas.

Reciprocante ĉi tiujn tri paŝojn 25-35 fojojn, la nombro da DNA-fragmentoj pliiĝos eksponente.

2

La eltrovemo de PCR estas ke malsamaj enkondukoj povas esti dizajnitaj por malsamaj celgenoj, tiel ke la celgenfragmentoj povas esti plifortigitaj en mallonga tempodaŭro.

Ĝis nun, PCR povas esti dividita en tri kategoriojn, nome ordinara PCR, fluoreska kvanta PCR kaj cifereca PCR.

La unua generacio de ordinara PCR

Uzu ordinaran PCR-amplifilon por plifortigi la celgenon, kaj poste uzu agarozan ĝelan elektroforezon por detekti la produkton, nur kvalita analizo povas esti farita.

La ĉefaj malavantaĝoj de la unua generacio PCR:

-Inklina al nespecifa plifortigo kaj falsaj pozitivaj rezultoj.

-La detekto daŭras longan tempon kaj la operacio estas maloportuna.

-Nur kvalita testado povas esti farita.

Duageneracia fluoreskeca kvanta PCR

Fluoreska kvanta PCR (Real-Time PCR), ankaŭ konata kiel qPCR, estas uzata por kontroli la amasiĝon de plifortigitaj produktoj per la amasiĝo de fluoreskaj signaloj per aldonado de fluoreskaj enketoj, kiuj povas indiki la progreson de la reagsistemo, kaj por juĝi la rezultojn per la fluoreska kurbo, kaj ĝi povas esti kvantigita helpe de Cq-valoro kaj norma kurbo.

Ĉar la qPCR-teknologio estas efektivigita en fermita sistemo, la probablo de poluado estas reduktita, kaj la fluoreskeca signalo povas esti monitorita por kvanta detekto, do ĝi estas la plej vaste uzata en klinika praktiko kaj fariĝis la domina teknologio en PCR.

La fluoreskaj substancoj uzitaj en realtempa fluoreska kvanta PCR povas esti dividitaj en: TaqMan-fluoreskaj sondiloj, molekulaj signostangoj kaj fluoreskaj tinkturfarboj.

1) Fluoreska sondilo TaqMan:

Dum PCR-plifortigo, specifa fluoreska enketo estas aldonita aldonante paron de enkondukoj.La enketo estas oligonukleotido, kaj la du finoj estas respektive etikeditaj kun raportisto fluoreska grupo kaj estingiga fluoreska grupo.

Kiam la sondilo estas sendifekta, la fluoreska signalo elsendita de la raportistogrupo estas sorbita de la estinga grupo;dum PCR-amplificado, la 5′-3′ eksonukleaza agado de Taq-enzimo fendas kaj degradas la enketon, igante la raportiston fluoreskan grupon kaj estingilon La fluoreska grupo estas apartigita, tiel ke la fluoreskeca monitora sistemo povas ricevi la fluoreskecan signalon, tio estas, ĉiufoje kiam DNA-fadeno estas plifortigita, la fluoreskeca signalo estas tute sinkronigita, la fluoreska formado estas tute sinkronigita kun fluoreskeco. la PCR-produkto.

2) SYBR-fluoreskaj tinkturfarboj:

En la PCR-reagsistemo, troo de SYBR-fluoreska tinkturfarbo estas aldonita.Post kiam la SYBR-fluoreska tinkturfarbo estas nespecife integrigita en la DNA-du-fadeno, ĝi elsendas fluoreskan signalon.La SYBR-tinkturfarba molekulo, kiu ne estas korpigita en la ĉenon, ne elsendos ajnan fluoreska signalo, tiel certigante la fluoreska signalo. La pliiĝo de PCR-produktoj estas tute sinkronigita kun la pliiĝo de PCR-produktoj.SYBR nur ligas al duoble-senhelpa DNA, tiel ke la degela kurbo povas esti uzita por determini ĉu la PCR-reago estas specifa.

3 4

3) Molekulaj signoj

Ĝi estas tigo-buklo duoble-etikedita oligonukleotid-enketo kiu formas harpinglan strukturon de proksimume 8 bazoj ĉe la 5 kaj 3 finoj.La nukleaacidosekvencoj ĉe ambaŭ finoj estas komplemente parigitaj, igante la fluoreskan grupon kaj la estingan grupon esti mallozaj.Proksime, ĝi ne produktos fluoreskecon.

5

Post kiam la PCR-produkto estas generita, dum la kalcia procezo, la meza parto de la molekula signostango estas parigita kun specifa DNA-sekvenco, kaj la fluoreska geno estas apartigita de la estingiga geno por produkti fluoreskecon.

6

La ĉefaj malavantaĝoj de duageneracia PCR:

Sentemo ankoraŭ mankas, kaj la detekto de malaltkopiaj specimenoj ne estas preciza.

Ekzistas fonvalorinfluo, kaj la rezulto estas sentema al interfero.

Tria generacio cifereca PCR

Cifereca PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) kalkulas la kopinumeron de la celsekvenco per finpunkta detekto, kaj povas elfari precizan absolutan kvantan detekton sen uzado de internaj kontroloj kaj normaj kurboj.

Cifereca PCR uzas finpunktodetekton kaj ne dependas de la Ct-valoro (cikla sojlo), do la cifereca PCR-reago estas malpli tuŝita de la plifortiga efikeco, kaj la toleremo al PCR-reakinhibitoroj estas plibonigita, kun alta precizeco kaj reproduktebleco.

Pro la karakterizaĵoj de alta sentemo kaj alta precizeco, ĝi ne estas facile interrompita de PCR-reagaj inhibitoroj, kaj ĝi povas atingi veran absolutan kvantigon sen normaj produktoj, kiu fariĝis esplora kaj aplikaĵa punkto.

Laŭ la malsamaj formoj de la reaga unuo, ĝi povas esti dividita en tri tipojn: mikrofluidaj, blato kaj gutetosistemoj.


Afiŝtempo: Jul-08-2021