• facebook
  • linkedin
  • youtube

 Fluoreskeca kvanta PCR (ankaŭ konata kiel TaqMan PCR, ĉi-poste referita kiel FQ-PCR) estas nova nuklea acida kvanta teknologio evoluigita fare de PE (Perkin Elmer) en Usono en 1995. Tiu teknologio estas bazita sur konvencia PCR aldonante fluoreskajn etikeditajn enketojn.Kompare kun fleksebla PCR, FQ-PCR havas multajn avantaĝojn por realigi sian kvantan funkcion.Ĉi tiu artikolo intencas mallonge priskribi la karakterizaĵojn, principojn, metodojn kaj aplikojn de la teknologio.

1 Karakterizaĵoj

FQ-PCR ne nur havas la altan sentivecon de ordinara PCR, sed ankaŭ pro la aplikado de fluoreskaj sondiloj, ĝi povas rekte detekti la ŝanĝon de fluoreska signalo dum PCR-amplifilo per la fotoelektra kondukta sistemo por akiri kvantajn rezultojn, kiu venkas multajn mankojn de konvencia PCR, do ĝi ankaŭ havas la altan specifecon de DNA-hibridado kaj la altan precizecon de spektroskopa teknologio.

Ekzemple, ĝeneralaj PCR-produktoj devas esti observitaj per agarosa ĝelelektroforezo kaj etidiobromida makulado kun transviola lumo aŭ per poliakrilamida ĝelelektroforezo kaj arĝenta makulado.Ĉi tio ne nur postulas multoblajn instrumentojn, sed ankaŭ postulas tempon kaj penon.La makuloj uzataj de Etidio-bromido estas malutilaj al la homa korpo, kaj ĉi tiuj komplikaj eksperimentaj proceduroj donas ŝancojn por poluado kaj falsaj pozitivoj.Tamen, FQ-PCR nur bezonas malfermi la kovrilon unufoje dum specimena ŝarĝo, kaj la posta procezo estas tute fermita-tuba operacio, kiu ne postulas PCR-post-pretigon, evitante multajn malavantaĝojn en konvenciaj PCR-operacioj.La eksperimento ĝenerale uzas la ABI7100 PCR-termociklilon evoluigitan de PE-firmao.

La instrumento havas la jenajn karakterizaĵojn: ① Larĝa apliko: Ĝi povas esti uzata por DNA kaj RNA PCR-produkta kvantigo, esploro pri gen-esprimo, detekto de patogenoj kaj optimumigo de PCR-kondiĉoj.② Unika kvanta principo: Uzante fluoreske etikeditajn enketojn, la kvanto de fluoreskeco akumuliĝos kun la PCR-ciklo post lasera ekscito, por atingi la celon de kvantigo.③ Alta laborefikeco: Enkonstruita 9600 PCR-termociklilo, komputilo kontrolita 1 ĝis 2 horoj por kompletigi la plifortigon kaj kvantigon de 96 specimenoj aŭtomate kaj sinkrone.④ Ne necesas ĝela elektroforezo: Ne necesas dilui kaj elektroforezi la specimenon, nur uzu specialan sondilon por detekti rekte en la reagtubo.⑤Neniu poluo en la dukto: La unika plene enfermita reagtubo kaj fotoelektra konduksistemo estas adoptitaj, do ne necesas zorgi pri poluo.⑥La rezultoj estas reprodukteblaj: la kvanta dinamika intervalo estas ĝis kvin grandordoj.Tial, ĉar ĉi tiu teknologio estis sukcese evoluigita, ĝi estis taksita de multaj sciencaj esploristoj kaj estis aplikata en multaj kampoj.

2 Principoj kaj metodoj

La funkciprincipo de FQ-PCR estas uzi la 5′→3′ eksonukleazan agadon de Taq-enzimo por aldoni fluoreske etikeditan enketon al la PCR-reagsistemo.La enketo povas specife hibridigi kun la DNA-ŝablono enhavita en la enkonduksekvenco.La 5′fino de la enketo estas etikedita kun la fluoreskeca emisio geno FAM (6-carboxyfluorescein, fluoreskeca emisiopinto ĉe 518nm), kaj la 3′end estas etikedita kun La fluoreskeca estinga grupo TAMRA (6-carboxytetramethylrhodamine, fluoreskeca emisiopinto de la fluoreskeca emisiopinto de 5832′beak estas etikedita kun La fluoreskeca ellasota grupo TAMRA (6-carboxytetramethylrhodamine, fluoreskeca emisiopinto de 5832′beak) estas etikedita. malhelpi la enketon esti etendita dum PCR-plifortigo.Kiam la enketo restas sendifekta, la estingilgrupo subpremas la fluoreskecemision de la elsenda grupo.Post kiam la elsenda grupo estas apartigita de la estinga grupo, la inhibicio estas levita, kaj la optika denseco ĉe 518nm pliiĝas kaj estas detektita de la fluoreskeca detekta sistemo. En la renatura fazo, la enketo hibridiĝas kun la ŝablono DNA, kaj la Taq-enzimo en la etendfazo moviĝas laŭ la DNA-ŝablono kun la etendaĵo de la enkonduko.Kiam la sondilo estas fortranĉita, la estinga efiko estas liberigita kaj la fluoreska signalo estas liberigita.Ĉiufoje kiam la ŝablono estas kopiita, enketo estas fortranĉita, akompanata de la liberigo de fluoreska signalo.Ĉar ekzistas unu-al-unu rilato inter la nombro da liberigitaj fluoroforoj kaj la nombro da PCR-produktoj, tiu tekniko povas esti uzita por precize kvantigi la ŝablonon.La eksperimenta instrumento ĝenerale uzas la ABI7100 PCR-termociklilon evoluigitan de PE-kompanio, kaj aliaj termocikliloj ankaŭ povas esti uzataj.Se la reakcia sistemo ABI7700 estas uzata por la eksperimento, post kiam la reago finiĝas, la kvantaj rezultoj povas esti rekte donitaj per komputila analizo.Se vi uzas aliajn termociklilojn, vi devas uzi fluoreskecan detektilon por mezuri la fluoreskecan signalon en la reagtubo samtempe por kalkuli RQ+, RQ-, △RQ.RQ+ reprezentas la rilatumon de la lumineska intenseco de la fluoreska emisiogrupo de la specimena tubo al la lumineska intenseco de la estinga grupo, RQ- reprezentas la rilatumon de la du en la malplena tubo, △RQ (△RQ=RQ+-RQ-) reprezentas la kvanton de fluoreskeca signalŝanĝo dum PCR Post kiam datumtraktado povas esti akirita, kvantaj rezultoj.Pro la enkonduko de fluoreskaj sondiloj, la specifeco de la eksperimento estas signife plibonigita.La enketo-dezajno ĝenerale devus renkonti la sekvajn kondiĉojn: ①La longo de la enketo devas esti ĉirkaŭ 20-40 bazoj por certigi la specifecon de ligado.②La enhavo de GC-bazoj estas inter 40% kaj 60% por eviti duobligon de unuopaj nukleotidsekvencoj.③ Evitu hibridiĝon aŭ interkovron kun enkondukoj.④ La stabileco de la ligo inter la enketo kaj la ŝablono estas pli granda ol la stabileco de la ligado inter la enkonduko kaj la ŝablono, do la Tm-valoro de la enketo devus esti almenaŭ 5 °C pli alta ol la Tm-valoro de la enkonduko.Krome, la koncentriĝo de la enketo, la homologio inter la enketo kaj la ŝablonsekvenco, kaj la distanco inter la enketo kaj la enkonduko ĉiuj havas efikon al la eksperimentaj rezultoj.

Rilataj produktoj:

Ĉinio Lnc-RT Heroᵀᴹ I (Kun gDNase) (Super Premix por unua-fadena cDNA sintezo de lncRNA) Fabrikisto kaj Provizanto |Foregene (foreivd.com)

Ĉinio Reala Tempo PCR Easyᵀᴹ-Taqman Fabrikisto kaj Provizanto |Foregene (foreivd.com)


Afiŝtempo: Oct-15-2021