RNase estas sentema vorto, kiun multaj studentoj, kiuj ofte faras RNA-eltirajn eksperimentojn, ne volas aŭdi.Plene armita, la RNA kiu estis finfine ĉerpita kun la tre toksaj reakciiloj fenolo kaj kloroformo estis degradita.Mi ne estas repacigita!!!Hodiaŭ, ni rigardu la originon de la fama Rnase.

Ribonukleazo (RNase), aŭ RNase, estas nukleazo kiu povas hidrolizi RNA en malgrandajn molekulojn.RNase, kiel malgranda molekula proteino, estas nekutime stabila .Konvencia alta temperaturo kaj altprema vapora steriligo kaj proteinaj inhibidores ne povas tute malaktivigi ĝin.La stabileco de RNase plejparte venas de la disulfidobligacioj en la strukturo.Ekzemple, la ofte uzata RNazo de bova pankreato havas nur 124 aminoacidojn, sed enhavas 4 disulfidajn ligojn.Sulfura ligo kaj disulfida ligo dotas RNazon per bonega termika stabileco.Krome, rnase havas relative malgrandan molekulpezon kaj povas rapide restarigi sian originan konformiĝon en multaj kazoj.

Krom esti ekstreme stabila,RNazoj estas ĉieaj en la laboratorio .RNazo estas biologia defenda mekanismo.Por ĉelo, eksogena RNA ofte estas mortiga.Kompare kun eksogena DNA, eksogena RNA ofte estas pli danĝera.RNA estas feliĉe transskribita kaj tradukita, do preskaŭ ĉiuj organismoj evoluigis RNazojn por defendi kontraŭ la invado de eksogena RNA.Tial, la bakteriaj ĉeloj kultivitaj en la laboratorio kaj vi, kiuj ĉerpas RNA, emanas la aromon de RNase.Homaj korpaj fluidoj (salivo, larmoj, ktp.) enhavas grandan kvanton da RNazo, do ne ploru kiam RNA estas degradita.Ju pli vi ploras, des pli malbona la RNA-degenero!!Fratino Daiyu ne taŭgas por eltiro de RNA!

Krome, via delikata haŭto ankaŭ enhavas multe da RNazo, kaj la markiloj, pipetoj, fridujpordoj kaj pordaj teniloj kiuj estis tuŝitaj de la haŭto ankaŭ enhavas RNazon.

Kun tiom da divagado, ni rigardu kiel trakti RNazojn.

La unua afero, pri kiu ĉiuj pensas kiam oni forigas RNA, estasDEPC(dietilpirokarbonato).DEPC plejparte malnaturas la proteinon per kombinado kun la imidazolringo de la RNase aktiva grupo histidino, tiel malhelpante la agadon de la enzimo.0.1% DEPC povas havi pli bonan forigan efikon sur Rnase, sed ni devas atenti, ke DEPC estas konata karcinogena, do speciala atento devus esti pagita kiam ĝi uzas.

Por RNase, ni devas komenci de du aspektoj,la unua estas malhelpi la agadon de endogena RNazo

Konvenciaj RNA-ekstraktaj reakciiloj kiel guanidino-izotiocianato kaj DTT enhavitaj en Trizol povas malfermi la disulfidan ligon de RNase, sed ankoraŭ ekzistas kelkaj RNasoj, precipe en histoprovaĵoj, do atentu malaltan temperaturon.

1.Tuj mergu la histan specimenon en likvan nitrogenon post elpreni ĝin, aŭ en komercan konservan solvon de RNA.

2.Post eltiro de la RNA de la ĉela specimeno, aldonu ĝin al la liza solvo kaj lizi ĝin sur la glaciskatolo.

3. Plej bone estas uzi likvan nitrogenon por mueli kiam histoprovaĵoj estas homogenigitaj.Kiam vi uzas elektran homogenigilon sen likva nitrogeno, atentu plene antaŭmalvarmigi la homogenitan adaptilon.

La dua estas eksogena DNazo

1.Estu plene armita, portu laboratorian mantelon, portu maskon, kaj nepre portu paron da novaj gantoj (ne estu tiom ŝparema!! Oni notu, ke Trizol estas super koroda, kaj ĝi ankaŭ estas tre forta tra gantoj, do ne gutu sur viajn manojn).

2.Ĉiuj uzitaj pipetkonsiloj, EP-tuboj, PCR-tuboj kaj aliaj ekipaĵoj devas esti de-RNase traktitaj.Ĝi povas esti trempita en 0.1% DEPC kaj tiam premita sub alta premo.Atentu la operacion en fumkapuĉo.Lokaj tiranoj povas rekte aĉeti konsumaĵojn por forigi enzimojn.

PS: Mi diru al vi maldiligentan metodon.Kvankam alta temperaturo kaj alta premo ne povas tute forigi RNazon, ĝi forigos grandan parton de ĝi.2 fojojn de alta temperaturo kaj alta premo havas bonan efikon, kaj la eltiro de RNA havas malmulte da efiko.

3.Alkoholo povas denaturigi proteinojn,do la RNA-eltira tablo povas esti forviŝita per 75% da alkoholo , kaj gantoj ankaŭ povas esti ŝprucitaj per alkoholo.

4.La fina RNA dissolva solvaĵo kaj centrifugiltubo ankaŭ devus esti de-RNase traktitaj.DEPC-akvo estas ofte uzata RNA-solvaĵo.Ni parolu pri la ĝusta preparmetodo de DEPC-akvo (memoru repaki la komercan DEPC kiam vi aĉetas ĝin)

Aldonu DEPC al ultrapura akvo je 1:1000, bone skuu, lasu stari dum la nokto je 37 °C, kaj steriligu je 121 °C sub alta temperaturo kaj alta premo dum 15 minutoj.DEPC-akvo povas esti stokita je -20 °C en 1ml alikvotoj.

Fine, por resumi: malalta temperaturo estas la ŝlosilo, konsumeblaj estas bone pritraktitaj, plene armitaj kaj malpli parolado!

Nu, jen por la hodiaŭa strategio.Mi deziras al vi la tutan RNA-koncentriĝon kaj purecon, kiujn vi menciis.Ambaŭ A260/A280 estas 2.0!!!

Kompreneble, se vi uzas aĉambra temperaturo operacio RNA eltiro ilaro, vi eble ne renkontas la suprajn problemojn.

Operacio ĉe ĉambra temperaturo, sen aldoni DNazon, ĉerpas totalan RNA de ĉeloj en 11 minutoj, kaj ĉerpas totalan RNA de bestaj histoj aŭ plantoj en 30 minutoj.

Por provaj specimenoj, bonvolu kontakti:overseas@foregene.com

Rilataj Produktoj:

https://www.foreivd.com/cell-total-rna-isolation-kit-product/

https://www.foreivd.com/animal-total-rna-isolation-kit-product/

https://www.foreivd.com/plant-total-rna/