Rekta PCR estas reago kiu rekte uzas bestajn aŭ plantajn histojn por plifortigo sen nukleaacida ekstraktado.En multaj manieroj, rekta PCR funkcias kiel regula PCR

La ĉefa diferenco estas la kutima bufro uzata en rekta PCR, la specimeno povas esti rekte submetita al la PCR-reago sen nuklea acida eltiro, sed ekzistas respondaj postuloj por la toleremo de la enzimoj kaj la kongruo de la bufro implikita en la rekta PCR-reago.

Kvankam ekzistas pli-malpli PCR-inhibitoroj en oftaj provaĵoj, rekta PCR ankoraŭ povas atingi fidindan plifortigon sub la ago de enzimoj kaj bufroj.La tradicia PCR-reago postulas altkvalitan nuklean acidon kiel ŝablonon, kiu povas malhelpi la glatan progreson de PCR-reago se la ŝablono enhavas proteinojn kaj aliajn malpuraĵojn.Rekta PCR estas nuntempe unu el la pli popularaj teknologioj en la kampo de molekula diagnozo.

01 Rekta PCR estis origine uzita por besto kaj planto

La plej frua apliko de rekta PCR estas en la kampo de bestoj kaj plantoj, kiel la sango, histo kaj hararo de la rato, kato, kokido, kuniklo, ŝafo, brutaro, ktp., plantfolioj kaj semoj, ktp., uzata por studi genotipadon, transgenan, plasmidan detekton, Genan knokaŭtan analizon, DNA-fontan identigon, analizon kaj aliajn kampojn de SNP.

Ĉi tiuj kampoj havas iujn komunajn trajtojn, tio estas, la cela gena enhavo estas relative alta kaj nukleacida eltiro estas ĝena, do rekta PCR povas ne nur ŝpari tempon kaj havi malgrandan efikon al la rezultoj, sed ankaŭ ŝpari koston.

Rekta PCR uzata por detekto de patogenoj estas afero de la lastaj jaroj, iuj fabrikantoj de reakciiloj de PCR faris multajn klopodojn en ĉi tiu direkto kiam ili faras novigon.Precipe en ĉi tiu COVID-19-epidemio, multaj tiaj detektaj produktoj aperis sur la merkato, kiel ekzemple SARS-CoV-2 Nucleic Acid Detection Kit (Multiplex PCR Fluorescent Probe Method) esplorita kaj evoluigita de Foregene, kiu uzas Realtempan RT PCR-teknologion (rRT-PCR) por kvalita detekto de homaj naznukleaj acidoj aŭ svastaj specimenoj en homaj naz-kofajaj specimenoj en 2-acidoj naz-kofajoj. s.

Foregene estas unu el la kompanioj uzantaj Direct PCR-teknologion, por la detekto de normala ORF1ab, N, E, kajvarianto genliniaj nukleaj acidoj en homaj nazofaringeaj aŭ orofaringeaj swabprovaĵoj kiel SARS-CoV-2 B.1.1.7 genlinio (UK), B.1.351 genlinio (ZA), B.1.617 genlinio (IND) kaj P.1 genlinio (BR).

02  Reakciiloj necesaj por rekta PCR

Specimena Lisato

La specimena lisato povas esti agordita memstare aŭ aĉetita.La diferenco en la konsisto de malsamaj markoj de lisato diferencas la lizkapablon, kaj tiam la liza tempo estos iomete malsama.Ekzemple, por la preparado de besthistospecimenoj, 30 minutoj aŭ dumnokta lizo estas ĝenerale rekomendita, kaj la lizosolvo por virusoj varias de 3-10 minutoj.

PCR majstra miksaĵo

Oni rekomendas uzi varm-komencan DNA-polimerazon por plibonigi specifan plifortigon kaj pliigi la plifortigan kapablon.La kerno de rekta PCR estas tre tolerema polimerazo.

Forigi aŭ malhelpi komponantojn en la provaĵo, kiuj influas DNA-plifortigon

Post kiam la specimeno estas prilaborita kun la lisato, proteinoj, lipidoj kaj aliaj ĉelaj derompaĵoj estos liberigitaj, ĉi tiuj substancoj malhelpos la PCR-reagon.Tial rekta PCR postulas la aldonon de responda forigo aŭ inhibitoroj por redukti la influon de ĉi tiuj faktoroj.

03  Kolekto de kvin scipoentoj de rekta PCR

Unue, Rekta PCR-teknologio estas rekta PCR-teknologio por diversaj biologiaj specimenoj.Sub ĉi tiu teknika kondiĉo, ne necesas disigi kaj ĉerpi la nuklean acidon, rekte uzi la histon specimenon kiel la objekton, kaj aldoni la cela geno enkondukoj estas plenumi la PCR reagon.

Due, Rekta PCR-teknologio ne nur estas tradicia DNA-ŝablona plifortiga teknologio, sed ankaŭ inkluzivas RNA-ŝablonan inversan transskribon PCR.

Trie, Rekta PCR-teknologio ne nur rekte elfaras rutinajn kvalitajn PCR-reagojn sur histoprovaĵoj, sed ankaŭ inkluzivas Realtempajn qPCR-reagojn, kio postulas, ke la reagsistemo havu fortan kontraŭ-fonan fluoreskecan interferkapablon kaj endogenan fluoreskecon estingigas la antagonisman kapablon.

Kvare, la specimenoj celitaj de la Rekta PCR-teknologio bezonas nur la liberigon de nukleaj acidaj ŝablonoj, kaj ne forigas proteinojn, polisakaridojn, saljonojn ktp, kiuj malhelpas la PCR-reagon.Kio postulas, ke la nuklea acida polimerazo kaj PCR-Miksaĵo en la reagsistemo havu bonegan reziston kaj adapteblecon por certigi enziman aktivecon kaj reproduktan precizecon sub kompleksaj kondiĉoj.

Kvine, la histo-provaĵo celita de Rekta PCR-teknologio sen ia traktado pri riĉigo de nukleaj acidoj kaj la kvanto de ŝablono estas tre malgranda, kio postulas, ke la reagsistemo havu ekstreme altan sentivecon kaj plifortigan efikecon.