Kontroli la agadon de enkondukoj kaj sondiloj en la frua stadio de PCR-reakciiloj kaj determini la plej taŭgajn reagkondiĉojn estas la antaŭkondiĉoj por certigi la glatan progreson de formalaj eksperimentoj.
Do kiel ni devas konfirmi la enketon en la frua etapo?
La ĉefaj indikiloj estas bazlinio, plifortiga kurbo, ct-valoro, plifortiga efikeco, malalta koncentriĝa specimena detekto, CV, ktp.
Bazlinio
La bazlinio estas la horizontala linio en la PCR plifortiga kurbo.En la unuaj malmultaj cikloj de la PCR plifortiga reago, la fluoreskeca signalo ne multe ŝanĝas kaj formas rektan linion.Ĉi tiu rekta linio estas la bazlinio.
Dum ekzamenado de PCR-enketoj, atentu ĉu la bazlinio estas ebena.La pureco de la enketkoncentriĝo influos la bazlinion, kiel ekzemple igi la bazlinion pliiĝi aŭ fali.La bazlinio ankaŭ estas tre intuicia indikilo.
Plifortiga Kurbo
Alia intuicia indikilo estas la formo de la plifortiga kurbo.Plej bone estas havi S-forman kurbon por eviti sekundaran plifortigon aŭ aliajn nenormalajn plifortigajn kurbojn.
Ct Valoro
La nombro da cikloj egalrilatantaj al la fleksiopunkto de la bazlinio ĝis la eksponenta kresko estas la Ct-valoro.
Por la sama specimeno, malsamaj primer-enketoj rezultigas malsamajn plifortigajn kurbojn, kaj la responda Ct-valoro estos tuŝita de la plifortiga efikeco kaj interfergrado.En teorio, ju pli malgranda la Ct-valoro de la enketo-sondilo, kiun ni elektas, des pli bone.
Plifortiga Efikeco
Unu el la plej fidindaj kaj stabilaj metodoj por taksi PCR-amplifigan efikecon estas la norma kurbo, kiu ankaŭ estas vaste rekonita de esploristoj.La metodo implikas fari serion de provaĵoj por kontroli la relativan nombron da celŝablonoj.Ĉi tiuj specimenoj estas kutime faritaj per seriaj diluoj de koncentritaj akciaj solvaĵoj, la plej ofte uzata estas 10-obla diluo.Uzante serion da diluitaj specimenoj, uzante norman qPCR-programon por amplifi por akiri la Cq-valoron, kaj fine desegni norman kurbon laŭ la koncentriĝo de ĉiu specimeno kaj la responda Cq-valoro por akiri la linearan ekvacion Cq= -klgX0+b, kaj la plifortigan efikecon E=10(-1 /k)-1.Dum uzado de qPCR por kvanta analizo, la plifortiga efikeco estas postulata por esti en la intervalo de 90% -110% (3.6>k>3.1).
Malalt-koncentriĝo Samples Detection
Kiam la specimena koncentriĝo estas malalta, la detektaj indicoj de malsamaj enketoj estas malsamaj.Ni elektas 20 malalt-koncentriĝajn specimenojn por reprodukti, kaj la unua-sonda sistemo kun la plej alta detekta indico estas la plej bona.
Koeficiento de Variado (CV)
10 duplikataj specimenoj povas esti detektitaj per malsamaj enketoj laŭ la linio-normo de la reakciilo por detekto de plifortigo de nuklea acido.
Kvantaj Reakciiloj:
Precizeco
La precizeco ene de unu aro devus renkonti: la koeficiento de variado (CV,%) de la logaritma valoro de la testa koncentriĝo estas ≤5%.Kiam la specimena koncentriĝo estas malalta, la koeficiento de variado (CV,%) de la logaritmo de la detekta koncentriĝo estas ≤10%
Kvalitaj reakciiloj:
Precizeco
La precizeco ene de unu aro devus renkonti:
(1) Koeficiento de variado de Ct-valoro (CV,%) ≤5%
La sama specimeno estas testata paralele 10 fojojn, kaj la testrezultoj estu konsekvencaj
Afiŝtempo: Sep-18-2021
