• facebook
  • linkedin
  • youtube

En la frua etapo de la eksplodo, pro la rapida evoluo, rapida diagnozo de suspektataj pacientoj estas la ŝlosilo por malhelpi COVID-19.Iuj aprobitaj reakciiloj pri detektado de nukleaj acidaj havas mallongan disvolvan tempon, kaj ekzistas problemoj kiel rapida agado-konfirmo, nesufiĉa reakciila optimumigo kaj grandaj diferencoj inter aroj;La problemoj de diversaj klinikaj laboratorioj en diversaj aspektoj de la nukleaacida detektoprocezo ankaŭ povas influi la precizecon de nukleaacidaj detektrezultoj.Ĉi tiu artikolo fokusiĝos pri la ŝlosilaj ligiloj kaj punktoj en la nuna detekto de nuklea acido SARS-CoV-2, kaj analizos la problemojn de falsa negativa kaj pozitiva reekzameno de laboratoria detekto de nuklea acido kaj klinika nekonsekvenco.

Principoj de Detekto de Nukleaj Acidoj de SARS-CoV-2

SARS-CoV-2 estas RNA-viruso kun genarsekvenco de proksimume 29 kb, kun 10 genoj, kiuj povas efike ĉifri 10 proteinojn.Virusoj estas kunmetitaj de RNA kaj proteino, kaj la plej ekstera tavolo estas ekstera tegaĵo kunmetita de lipidoj kaj glikoproteinoj.Interne, la proteinkapsido envolvas la RNA en ĝi, tiel protektante la facile degradan RNA (P1).

zfgd

P1 Strukturo de SARS-COV-2

Virusoj invadas ĉelojn tra specifaj ĉelaj surfacreceptoroj por kaŭzi infekton, kaj uzas gastigajn ĉelojn por reproduktiĝi.

La principo de virusa nuklea acido-detekto devas eksponi la virusan RNA tra ĉela lisato, kaj tiam uzi realtempan fluoreskan inversan transskribo-polimerazan ĉenreakcion (RT-PCR) por detekto.

La ŝlosilo al la detekta principo estas uzi enkondukojn kaj enketojn por atingi "celan kongruon" de nukleaacidaj sekvencoj, tio estas trovi la nukleaacidan sekvencon de SARS-CoV-2, kiu estas diferenca de aliaj virusoj en ĉirkaŭ 30,000 bazoj (la simileco de nuklea acido al aliaj virusoj) "Malalta" areo), desegni enkondukojn kaj sondilojn.

La enkondukoj kaj enketoj estas tre kongruaj kun la specifa regiono de SARS-CoV-2 nuklea acido, tio estas, la specifeco estas tre forta.Post kiam la realtempa fluoreska RT-PCR-amplifiga rezulto de la provaĵo estas pozitiva, ĝi pruvas, ke SARS-CoV-2 ĉeestas en la specimeno.Vidu P2.

zfgd2

P2 Paŝoj de SARS-CoV-2-nukleacida determino (realtempa fluoreska RT-PCR)

Kondiĉoj kaj postuloj de laboratorio por detekto de nuklea acido SARS-CoV-2

Laboratorioj de testado de nukleaj acidoj estas la plej idealaj por medioj de negativa premo, kaj ili devas atenti pri monitorado de premo, konservi aeron flui kaj forigi aerosolojn.Prova personaro de nuklea acido devas havi respondajn kvalifikojn, ricevi koncernan trejnadon pri polimeraza ĉenreago kaj trapasi la taksadon.La laboratorio devas esti strikte administrita, zonita surloke, kaj senrilata dungitaro estas strikte malpermesita eniri.La pura areo devas esti ventolita kaj malinfektita surloke.Koncernaj eroj estas metitaj en zonojn, puraj kaj malpuraj estas apartigitaj, anstataŭigitaj ĝustatempe kaj senpoluigitaj surloke.Rutina desinfekto: Klor-enhava desinfektaĵo estas la ĉefa solvo por pli grandaj areoj, kaj 75% da alkoholo povas esti uzata por malgrandaj areoj.Bona maniero trakti aerosolojn estas malfermi fenestrojn por ventolado, kaj aermalinfektado ankaŭ povas esti farita per transviolaj radioj, filtrado kaj aermalinfekto.

Ŝlosilaj ligiloj kaj parametroj de SARS-CoV-2 nukleaacida determino (realtempa fluoreska RT-PCR)

Kvankam laboratorioj ĝenerale tre atentas "detekto" de nuklea acido, fakte, "ekstraktado" de nuklea acido ankaŭ estas unu el la ŝlosilaj paŝoj por sukcesa detekto, kiu estas proksime rilata al la kolekto kaj stokado de virusaj specimenoj.

Nuntempe, la plej uzataj spiraj specimenoj, kiel nazofaringaj ŝumoj, uzas la duan metodon, kiu estas malaktiviga (konservado) solvo preparita surbaze de nukleacida eltiro kaj lizosolvo.Unuflanke, ĉi tiu virusa konserva solvo povas denaturigi la proteinon de la viruso, perdi sian agadon kaj ne plu esti infekta, kaj plibonigi la sekurecon de la transporta kaj detekta stadio;aliflanke, ĝi povas rekte fendi la viruson por liberigi la nuklean acidon, forigi la nuklean acidan malkomponan enzimon kaj malhelpi la viruson.La RNA estas degradita.

Virusa prova solvaĵo preparita surbaze de nukleacida ekstrakta lizosolvo.La ĉefaj komponantoj estas ekvilibraj saloj, etilendiaminotetraaceta acida kelato agento, guanidina salo (guanidina isotiocianato, guanidina klorhidrato, ktp.), anjona surfaktant (dodekano) Natria sulfato), katjona surfaktant (tetradecyl trimetilamonio oxalato), fenolo, 8-hidrotiksinolazo aŭ pluraj aliaj proteinoj, 8-hidrotiksinotolo kaj aliaj komponantoj.Nuntempe, ekzistas multaj specoj de nukleaacidaj eltiraj ilaroj, kaj malsamaj nukleacidaj eltiraj kaj purigaj reakciiloj estas uzataj.Eĉ se la sama nukleacida ekstraktado kaj puriga reakciilo estas uzataj, la eltiraj proceduroj de ĉiu ilaro estas malsamaj.

Nuntempe, la produktoj aprobitaj de la Nacia Administracio pri Medicinaj Produktoj estas elektitaj surbaze de la genoj ORF1ab, E kaj N en la SARS-CoV-2-genaro.La detektprincipoj de malsamaj produktoj estas esence la samaj, sed iliaj enkondukoj kaj enketdezajnoj estas malsamaj.Ekzistas unu-celaj segmentoj (ORF1ab), du-celaj segmentoj (ORF1ab, N aŭ E), kaj tri-celaj segmentoj (ORF1ab, N kaj E).La diferenco inter detekto kaj interpretado, nuklea acida eltiro kaj realtempa fluoreska RT-PCR-reakcia sistemo devus raporti al la koncernaj instrukcioj pri kit, kaj rekomendas, ke uzantoj strikte sekvu la interpretan metodon specifitan en la instrukcioj por interpretado.La komunaj regionoj, enkondukoj kaj enketsekvencoj plifortigitaj per realtempa fluoreska RT-PCR estas montritaj en P3.

zfgd3

P3 La loko de la SARS-CoV-2 amplikoncelo sur la genaro kaj la sekvenco de enkondukoj kaj enketoj

Interpreto de la rezultoj de SARS-CoV-2-nukleacida determino (Real-Time fluoreska RT-PCR)

"Pneumonia Preventado kaj Kontrola Plano por SARS-CoV-2-Infekto (Dua Eldono)" unuafoje klarigis la kriteriojn por juĝi la rezultojn de ununura gena plifortigo:

1. Neniu Ct aŭ Ct≥40 estas negativa;

2. Ct<37 estas pozitiva;

3. La Ct-valoro de 37-40 estas la grizskala areo.Oni rekomendas ripeti la eksperimenton.Se la rezulto de refari Ct<40 kaj la plifortiga kurbo havas evidentajn pintojn, la specimeno estas taksata kiel pozitiva, alie ĝi estas negativa."

La tria eldono de la gvidilo kaj la kvara eldono de la gvidilo daŭrigis la suprajn kriteriojn.Tamen, pro la malsamaj celoj uzataj en komercaj ilaroj, la menciita 3-a eldono de la gvidilo ne donis la kriteriojn por determini la kombinaĵon de celoj, emfazante La instrukcioj provizitaj de la fabrikanto triumfos.Komencante de la kvina eldono de la gvidlinioj, du celoj estis klarigitaj, precipe la juĝkriterioj por ununura celo kiu estas malfacile juĝi.Tio estas, se la laboratorio volas konfirmi, ke kazo estas pozitiva por detekto de nuklea acido SARS-CoV-2, la jenaj devas esti plenumitaj 1 el 2 kondiĉoj:

(1) Du celoj de SARS-CoV-2 (ORF1ab, N) en la sama specimeno estas testitaj pozitivaj per realtempa fluoreska RT-PCR.Se ununura celo estas pozitiva, re-specimenigo kaj re-testado estas postulataj.Se la testrezultoj estas Se la ununura celo ankoraŭ estas pozitiva, ĝi estas juĝita kiel pozitiva.

(2) Du specimenoj de realtempa fluoreska RT-PCR montris unu celon pozitivan samtempe aŭ du specimenoj de la sama tipo montris ununuran celon pozitivan testrezulton, kiu povas esti juĝita kiel pozitiva.Tamen, la gvidlinioj ankaŭ emfazas, ke la negativaj rezultoj de provoj de nukleaj acidoj ne povas ekskludi infekton de SARS-CoV-2.Faktoroj kiuj povas kaŭzi falsajn negativojn devas esti ekskluditaj, inkluzive de malbona provaĵkvalito (spiraj provaĵoj de orofaringo kaj aliaj partoj), specimenkolekto tro frue aŭ tro malfrue, Provaĵoj ne estis stokitaj, transportitaj, kaj prilaboritaj ĝuste, kaj la teknologio mem havis problemojn (virusvario, PCR-inhibicio), ktp.

Kaŭzoj de falsaj negativoj en la detekto de SARS-CoV-2

La koncepto de "falsa negativo" en nuklea acida testado, kiu estas nuntempe koncerna, ofte rilatas al "falsaj negativoj" en kiuj la nukleaacidaj testrezultoj estas malkongruaj kun klinikaj manifestiĝoj, tio estas, klinikaj simptomoj kaj bildigaj rezultoj estas tre suspektataj pri COVID-19, sed nukleaj acidaj testoj estas ĉiam "negativaj" multfoje.La Klinika Laboratorio-Centro de la Nacia Sankomisiono klarigis la "falsan negativan" SARS-CoV-2-teston.

(1) Estas certa kvanto da viruso en la ĉeloj de la infektita persono.Ekzistantaj datumoj montras, ke post kiam la korpo estas infektita de la viruso, la viruso eniras la gorĝon tra la nazo kaj buŝo, poste al la trakeo kaj bronkoj, kaj tiam atingas la alveolojn.La infektita persono spertos la inkubacion, mildajn simptomojn, kaj poste la procezon de severaj simptomoj, kaj malsamajn stadiojn de la malsano.Kaj la kvanto de viruso ĉeestanta en malsamaj partoj de la korpo estas malsama.

Koncerne la virusŝarĝon de ĉeltipoj, alveolaraj epiteliĉeloj (malsupra spira vojo)> aeravojaj epiteliĉeloj (supra spira vojo)> fibroblastoj, endoteliaj ĉeloj kaj makrofagoj ktp.;el la specimena tipo, alveola lava fluido (la plej Bonege)>profunda tussputo>nazofaringa swab>orofaringa swab>sango.Krome, la viruso ankaŭ povas esti detektita en feko.Tamen, konsiderante la oportunon de operacio kaj la akcepto de pacientoj, la ofte uzata klinika specimena ordo estas orofaringa swab>nazofaringa swab>bronka lavlikvaĵo (kompleksa operacio) kaj profunda sputo (kutime seka tuso, malfacile akirebla).

Tial, la kvanto de viruso en la ĉeloj de la orofaringo aŭ nazofaringo de iuj pacientoj estas malgranda aŭ ekstreme malalta.Se nur specimenoj de la orofaringo aŭ nazofaringo estas prenitaj por testado, la virusa nuklea acido ne estos detektita.

(2) Neniuj virus-enhavantaj ĉeloj estis kolektitaj dum specimena kolekto, aŭ virusa nuklea acido ne estis efike konservita.

[① Netaŭga kolekto-ejo, ekzemple, kiam oni kolektas orofaringajn swabojn, la kolekto profundo ne sufiĉas, la kolektitaj nazofaringaj swaboj ne estas kolektitaj profunde en la nazkavo, ktp. Plejparto de la ĉeloj kolektitaj povas esti senvirusaj ĉeloj;

②Sampling swabs estas uzataj malĝuste.Ekzemple, sintezaj fibroj kiel PE-fibro, poliestera fibro kaj polipropilena fibro estas rekomenditaj por la materialo de la swabkapo.Naturaj fibroj kiel kotono estas uzataj en reala operacio (forta adsorbado de proteino kaj ne facile forlavi) Kaj nilonaj fibroj (malbona akvosorbado, kondukante al nesufiĉa specimena volumo);

③Malĝusta uzo de virusaj stokaj tuboj, kiel misuzo de polipropileno aŭ polietilenaj plastaj stokaj tuboj, kiuj estas facile sorbi nukleajn acidojn (DNA/RNA), rezultigante malpliiĝon de la koncentriĝo de nuklea acido en la stokada solvo.Praktike oni rekomendas uzi polietilen-propilenan polimerplaston kaj iujn speciale traktitajn polipropilenaj plastajn ujojn por stoki virusajn nukleajn acidojn.]

[① Netaŭga kolekto-ejo, ekzemple, kiam oni kolektas orofaringajn swabojn, la kolekto profundo ne sufiĉas, la kolektitaj nazofaringaj swaboj ne estas kolektitaj profunde en la nazkavo, ktp. Plejparto de la ĉeloj kolektitaj povas esti senvirusaj ĉeloj;

②Sampling swabs estas uzataj malĝuste.Ekzemple, sintezaj fibroj kiel PE-fibro, poliestera fibro kaj polipropilena fibro estas rekomenditaj por la materialo de la swabkapo.Naturaj fibroj kiel kotono estas uzataj en reala operacio (forta adsorbado de proteino kaj ne facile forlavi) Kaj nilonaj fibroj (malbona akvosorbado, kondukante al nesufiĉa specimena volumo);

③Malĝusta uzo de virusaj stokaj tuboj, kiel misuzo de polipropileno aŭ polietilenaj plastaj stokaj tuboj, kiuj estas facile sorbi nukleajn acidojn (DNA/RNA), rezultigante malpliiĝon de la koncentriĝo de nuklea acido en la stokada solvo.Praktike oni rekomendas uzi polietilen-propilenan polimerplaston kaj iujn speciale traktitajn polipropilenaj plastajn ujojn por stoki virusajn nukleajn acidojn.]

(4) La funkciado de klinika laboratorio ne estas normigita.Specimena transportado kaj konservado, normigita funkciado de klinikaj laboratorioj, rezulta interpreto kaj kvalita kontrolo estas la ŝlosilaj faktoroj por certigi la precizecon kaj fidindecon de testrezultoj.Laŭ la rezultoj de la ekstera kvalita taksado farita de la Klinika Laboratorio-Centro de la Nacia Sankomisiono la 16-24-an de marto 2020, el la 844 laboratorioj kiuj ricevis validajn rezultojn, 701 (83,1%) estis kvalifikitaj, kaj 143 (16,9%) ne estis.Kvalifikitaj, la ĝeneralaj laboratoriaj testaj kondiĉoj estas bonaj, sed malsamaj laboratorioj ankoraŭ havas diferencojn en persona operacia kapablo, unucela pozitiva specimena interpretkapablo kaj kvalitkontrolo.

Kiel redukti la falsan negativon de detekto de nuklea acido SARS-CoV-2?

Redukti falsajn negativojn en nukleaacida detekto devus esti optimumigita de la kvar aspektoj de produktado de falsaj negativoj.

(1) Estas certa kvanto da viruso en la ĉeloj de la infektita persono.La koncentriĝo de la viruso en malsamaj partoj de la korpo de suspektataj infektitaj personoj estos malsama en malsamaj tempoj.Se ne ekzistas faringo, ĝi povas esti en bronka lava fluidaĵo aŭ feko.Se pluraj specoj de specimenoj povas esti kolektitaj samtempe aŭ en malsamaj stadioj de malsano-progresado por testado, Helpos eviti falsajn negativojn.

(2) Ĉeloj enhavantaj viruson devas esti kolektitaj dum specimena kolekto.Ĉi tiu problemo povas esti solvita en granda mezuro plifortigante la trejnadon de specimenaj kolektantoj.

(3) Fidindaj IVD-reakciiloj.Farante esploradon pri la detekta rendimento-taksado de reakciiloj je nacia nivelo, kaj diskutante la ekzistantajn problemojn, la detekta efikeco de reakciiloj povas esti plu plibonigita kaj la sentemo de analizo povas esti plibonigita.

(4) Normigita funkciado de klinikaj laboratorioj.Plifortigante la trejnadon de laboratoriopersonaro, kontinue plibonigante la laboratoriokvalitan administradsistemon, certigante raciajn dividojn, kaj plibonigante la kapablon de personaro por detekti, eblas redukti falsajn negativojn pro nekonvenaj laboratoriooperacioj.

Kialoj por la retesta pozitivo de SARS-CoV-2 nuklea acida testo en resaniĝintaj kaj eligitaj pacientoj

La "Diagnozo kaj Traktado de COVID-19 (Sepa Eldono de Provo)" klare kondiĉas, ke unu el la kriterioj por ke pacientoj kun COVID-19 estu resanigitaj kaj eligitaj el la hospitalo estas, ke du sinsekvaj specimenoj de spira vojo havas negativan provon de nuklea acido (almenaŭ 24 horojn dise), sed estas tre malmultaj.

(1) SARS-CoV-2 estas nova viruso.Necesas plu kompreni ĝian patogenan mekanismon, la plenan bildon de la malsano kaŭzita kaj la karakterizaĵojn de la malsano.Tial, unuflanke, necesas plifortigi la administradon de eligitaj pacientoj kaj fari 14-tagan medicinan observadon.Faru sekvadon, sankontroladon kaj sanan gvidadon por profundigi la komprenon de la tuta procezo de la apero, evoluo kaj rezulto de la malsano.

(2) La paciento povas esti infektita kun la viruso denove.Akademiano Zhong Nanshan diris: Ĉar resanigitaj pacientoj havas antikorpojn, SARS-CoV-2 povas esti forigita per antikorpoj kiam ili denove invadas.Estas multaj kialoj, kiuj povas esti la kaŭzo de la reakirita paciento, aŭ ĝi povas esti rilata al la mutacio de la viruso, aŭ eĉ la kaŭzo de laboratoriotestado.Se ĝi estas la viruso mem, la mutacio SARS-CoV-2 povas kaŭzi ke la antikorpo produktita de la resanita paciento estu neefika kontraŭ la mutaciita viruso.Se la paciento denove estas infektita kun la mutaciita viruso, la nuklea acida testo povas esti pozitiva denove.

(3) Koncerne al laboratoriaj testaj metodoj, ĉiu testa metodo havas siajn limojn.Detekto de nuklea acido SARS-CoV-2 ŝuldiĝas al la elekto de gensekvenco, la komponado de reakciiloj, la sentemo de la metodo kaj aliaj kialoj, kondukante al la ekzistantaj ilaroj havas siajn proprajn pli malaltajn detektajn limojn.Post kiam la paciento estas traktita, la viruso en la korpo malpliiĝas.Kiam la virusŝarĝo en la provaĵo estas sub la pli malalta limo de detekto, "negativa" rezulto aperos.Tamen ĉi tiu rezulto ne signifas, ke la viruso en la korpo tute malaperis.La viruso povas esti post kiam la kuracado estas ĉesigita.Revigliĝo”, daŭrigu kopii.Tial oni rekomendas revizii unufoje semajne ene de 2 ĝis 4 semajnoj post elfluo.

(4) Nuklea acido estas la genetika materialo de la viruso.La viruso estas mortigita post kiam la paciento spertis kontraŭvirusan traktadon, sed la ceteraj virusaj RNA-fragmentoj daŭre estas retenitaj en la homa korpo, kaj ne estas tute eligitaj el la korpo.Kelkfoje, sub certaj cirkonstancoj, ĝi povas esti pli retenita.Longe, kaj ĉi-momente la provo de nuklea acido estos "pasema" pozitiva.Kun la plilongigo de la resaniĝotempo de la paciento, post kiam la restaj fragmentoj de RNA en la korpo estas iom post iom elĉerpitaj, la rezulto de la testo de nuklea acido povas fariĝi negativa.

(5) La rezulto de la testo de nuklea acido de SARS-CoV-2 nur pruvas la ĉeeston aŭ foreston de virusa RNA, kaj ne povas pruvi la aktivecon de la viruso kaj ĉu la viruso estas transdonebla.Necesas pruvi ĉu paciento, kiu denove havas pozitivan nuklean acidan teston, denove fariĝos fonto de infekto.Estas necese efektivigi viruskulturon sur klinikaj specimenoj kaj kultivi "vivan" viruson por pruvi, ke ĝi estas infekta.

Resumo

Resume, SARS-CoV-2 nuklea acido testas falsajn negativojn, retestajn pozitivojn kaj aliajn kondiĉojn, kiuj malkongruas kun klinikaj manifestiĝoj, ne povas esti tute evititaj.En efektiva kribrado kaj testado, oni rekomendas kombini klinikajn simptomojn, bildigajn ekzamenojn (CT) kaj eksperimentojn Laboratesto (nuklea acida testo + virus-specifa antikorpa testo) rezultoj por ampleksa diagnozo por malhelpi maltrafitan diagnozon kaj misdiagnozon.Se la testrezultoj estas evidente malkongruaj kun la klinikaj manifestiĝoj, oni rekomendas fari ampleksan analizon de la tuta testa ligo (provaĵkolekto, cirkulado kaj prilaborado ligiloj) por ekskludi SARS-CoV-2 viruso frua infekto, ripetiĝanta infekto aŭ kombinita kun aliaj spira virus infektoj, ktp.Se kondiĉoj permesas, oni rekomendas kolekti pli sentemajn specimenojn kiel sputon aŭ alveolavan lavan fluidaĵon por reekzameno.

Rilataj Produktoj:

SARS-CoV-2 Nukleika Acida Detekta Ilaro (Multpleksa PCR Fluoreska Sonda Metodo)


Afiŝtempo: Sep-03-2021